复合香辛料提取物对哈尔滨风干肠中生物胺形成的抑制作用

孙钦秀，杜洪振，李芳菲，郑冬梅，孔保华*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

复合香辛料提取物对哈尔滨风干肠中生物胺形成的抑制作用

孙钦秀，杜洪振，李芳菲，郑冬梅，孔保华*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

研究复合香辛料提取物（肉桂、丁香和八角按质量比1∶1∶1混合）不同添加量（0.1、0.3、0.5 g/kg）对哈尔滨风干肠发酵过程中生物胺形成的抑制作用，以及对风干肠理化指标、微生物指标和感官品质的影响。结果表明，复合香辛料提取物可以有效抑制生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、组胺、2-苯乙胺和色胺）的积累（P＜0.05），减少脂肪氧化产物硫代巴比妥酸值并抑制好氧菌的生长，且抑制效果随添加量的增加而增大（P＜0.05）。但是添加0.5 g/kg复合香辛料提取物会产生过重的香辛料气味，影响产品感官可接受性。风干肠中复合香辛料提取物添加量为0.3 g/kg时，可有效抑制产品中生物胺积累，且可改善产品的感官品质。

风干肠；香辛料提取物；生物胺；理化指标；微生物指标；感官品质

哈尔滨风干肠是我国北方的一种传统肉制品[1]，目前，传统风干肠的加工方式仍以自然发酵为主，需要的发酵时间较长，产品品质不稳定，且容易腐败变质，并可能会产生生物胺等有害物质，危害人体的健康；因此发酵肉制品中生物胺的控制成为国内外研究的重点。

香辛料提取物是一种天然植物提取物，含有芳香或刺激性挥发油、有机酸及辣味成分，添加香辛料提取物不仅能赋予食物特定的风味、颜色及香味，而且还可以抑制多种微生物的生长[2]。许多研究表明香辛料提取物可以通过降低腐败菌的生长来抑制食品中生物胺的形成。陈颖等[3]研究表明添加复合香辛料提取物（生姜精油、肉桂精油、八角精油、丁香精油、茶多酚）对香肠中色胺、尸胺、组胺和酪胺的积累具有显著的抑制效果。Mah等[4]研究表明大蒜、丁香、桂皮、大葱和红胡椒粉等植物提取物对发酵鯷鱼中腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺具有显著的抑制效果，其中大蒜的抑制效果最好。以上报道说明香辛料的使用对生物胺的抑制作用有一定的效果，前期实验研究了单一香辛料和复合香辛料对风干肠发酵过程中生物胺的抑制作用，结果表明肉桂、丁香和八角（质量比1∶1∶1）复合组对生物胺的抑制效果最好；因此本实验主要研究复合香辛料提取物（肉桂、丁香和八角按质量比1∶1∶1混合）的添加量对风干肠发酵过程中生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、组胺、2-苯乙胺和色胺）的抑制作用，同时考察其对风干肠理化特性（pH值、水分活度、水分含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值）、微生物指标（总好氧菌数、乳酸菌总数、肠杆菌总数）和感官品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后腿肉、猪背膘、精盐、曲酒、味素、肉桂、丁香、八角 哈尔滨香坊大润发超市；生物胺标准品美国Sigma公司；乙腈 德国Merck公司；盐酸、高氯酸、乙醇、甲醇、邻苯二甲醛、辛烷磺酸钠、冰乙酸、硼酸、氢氧化钾、无水乙酸钠、硼酸、β-巯基乙醇、氧化镁、三氯甲烷、三氯乙酸、TBARS、氢氧化钠、亚硝酸盐、葡萄糖 哈尔滨盛达化验仪器销售公司。配制以上试剂的水为超纯水，乙腈，甲醇为色谱纯，其余为分析纯。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；AL104精密电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；721型可见分光光度计上海元析仪器有限公司；GC-3L小型灌肠机 瑞安市鸿飞机械有限公司；T18 basic匀浆机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 哈尔滨风干肠的制作

将猪瘦肉和猪肥肉按质量比9∶1进行混合，用筛板孔径为1.5 cm的绞肉机绞碎，然后按以下质量分数加入水（3%）、辅料盐（2.5%）、亚硝酸盐（0.01%）、曲酒（1%）、葡萄糖（5%）、味素（0.3%酸盐），并在不同组中分别加入不同含量的复合香辛料提取物（0.0、0.1、0.3、0.5 g/kg），将每组肠馅分别灌入猪肠衣中，制成直径约3 cm、质量约0.15 kg的肠。将所有制好的肠在温度为（25±2）℃、相对湿度为30%～50%的条件下风干24 h，然后转移到恒温恒湿箱于（25±2）℃、相对湿度75%～80%条件下进行发酵，在第0、3、6、9天时取样检测。

1.3.2 实验设计

香辛料提取物的制备参照陈璐等[5]的方法略作改动，将买来的肉桂、丁香、八角置于鼓风干燥箱中，60 ℃烘干24 h，用超微细粉碎机将烘干的肉桂、丁香、八角粉碎，并将粉碎后的粉末过40 目筛，准确称取筛选后的粉末50 g，加入盛有体积分数95%食用酒精的400 mL烧杯中，将烧杯置于55 ℃的恒温水浴锅中，并用电子搅拌器800 r/min搅拌12 h，将溶液抽滤，并将滤渣重复提取2 次，将3 次所得的滤液在55 ℃条件下用旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，将冷冻干燥物研磨成粉末，置于-20 ℃冰箱保存待用。将肉桂、丁香和八角的醇溶提取物的冻干粉按照质量比1∶1∶1进行复配，制得复合香辛料提取物。

本实验共制作了4 组风干肠，分别添加0.0（对照组）、0.1、0.3、0.5 g/kg复合香辛料提取物，在第0、3、6、9天取样测定生物胺含量、理化指标和微生物指标，并在第9天取样进行感官评价。

1.3.3 生物胺含量的测定

生物胺含量的测定参考Latorre-Moratalla等[6]的方法略作改动，采用高效液相色谱柱后衍生法检测生物胺的含量，实验采用高效液相色谱仪联合C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）和荧光检测器进行检测。样品进样量10 μL，流动相流速1 mL/min，衍生剂流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，衍生池温度45 ℃，荧光探测器激发波长330 nm，发射波长465 nm。梯度洗脱程序为：流动相A起始体积分数75%保持10 min，在20 min时降至70%，38 min时降至0%，并保持至41 min，42 min时流动相A的升至75%。

1.3.4 pH值、水分含量和水分活度的测定

pH值的测定参照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》[7]。水分含量的测定参照GB/T 9695.15—2008《肉与肉制品 水分含量测定》[8]。将样品切碎，铺满样品盒底部，使用水分活度仪测定水分活度。

1.3.5 TBARS值的测定

TBARS值的测定参照Wang等[9]的方法略作修改，准确称取2.0 g切碎的样品放入试管中，分别加入3 mL TBARS溶液和17 mL三氯乙酸-盐酸溶液（2.5 g三氯乙酸加入0.6 mL 0.6 mol/L盐酸溶液中，用双蒸水定容至100 mL），混匀后沸水浴中加热30 min，迅速冷却至室温，吸取5 mL反应后的样品加入等体积的三氯甲烷，1 000×g离心10 min，532 nm波长处测量上清液的吸光度。TBARS值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的质量表示，计算如公式（1）所示。

式中：A532nm为样品的吸光度；V为样品的体积/mL；M为丙二醛的分子质量/（g/mol）；ε为摩尔消光系数，15 200 L/（mol·cm)；l为光程/cm；m为肉样的质量/kg。1.3.6 微生物数量的测定

微生物数量的测定根据Wang Yongli等[10]的方法略作改动，无菌条件下，取去除脂肪和结缔组织切碎的肠10.0 g，加入90 mL的生理盐水，均质2 min。10 倍梯度稀释溶液，每个溶液做3 个平行。在营养琼脂固体培养基上37 ℃培养48 h后进行好氧菌计数；在乳酸菌培养基中30 ℃培养48 h后进行乳酸菌的计数；在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂固体培养基中37 ℃培养48 h后进行肠杆菌的计数。

1.3.7 感官评价

感官评价的方法参照Fan Wenjiao等[11]的方法略作改动，感官评定人员根据7 分制原则进行打分，评分指标包括颜色（7 分为颜色红润有光泽；1 分为颜色暗黑无光泽）、气味（7 分为具有发酵肉制品特有的风味；1 分为风味较差）、滋味（7 分为浓郁的香味；1 分为滋味很差）、酸味（7 分为酸味很重，无法接受；1 分为没有酸味）、口感（7 分为肉质非常硬；1 分为肉嫩）和总体可接受性（7 分为可接受性高；1 分为可接受性低）。

1.4 数据统计分析

所有数据的分析用分析软件Statistix 8.1，结果表示为，每组实验重复3 次。利用LSD法分析差异显著性，P＜0.05表示差异性显著。采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠生物胺含量的影响

图1 不同添加量复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中6 种生物胺含量的变化Fig. 1 Changes in the contents of six BAs in sausages added with different amounts of spice extract during fermentation

如图1A所示，随着发酵的进行，所有风干肠的酪胺含量均呈上升趋势，添加复合香辛料提取物对酪胺的增加具有抑制作用，且随着添加量的增加，酪胺增加量减少。至发酵第9天，添加量为0.1 g/kg组酪胺含量（32.83 mg/kg）与对照组差异不显著（P＞0.05），添加量为0.3 g/kg组风干肠酪胺含量显著低于添加量为0.1 g/kg组（P＜0.05），添加量0.5 g/kg复合香辛料提取物组风干肠酪胺含量最低。已有报道证明，香辛料提取物具有一定的抑菌作用，尤其可以抑制腐败微生物的生长[12]，发酵肉制品中一些腐败微生物（如肠杆菌）的生长可以造成生物胺含量的积累[13]。唐裕芳等[14]研究表明肉桂提取物中主要含有挥发油、二萜及其糖苷、黄烷醇及其多聚体，此外还含有黄酮类、多酚类等化合物，其中最重要的活性成分是肉桂醛，肉桂醛对微生物的生长具有很强的抑制效果。张慧芸等[15]研究发现丁香提取物主要含有丁香酚、石竹烯、（Z,Z）-9,12-十八碳二烯酸甲酯、α-石竹烯等，这些成分具有较强的抑菌效果。八角提取物中主要含有大茴香醛、对丙酮基茴香醚、大茴香酸等，其中多种挥发性成分对多种微生物具有抑制作用[16]。因此，将肉桂、丁香和八角提取物添加到发酵肉制品中可以有效抑制酪胺的积累。

腐胺是发酵肉制品中最常见的生物胺之一[17]，由图1B可看出，发酵第0天，各组风干肠中均没有腐胺检出，发酵初期，由于腐胺阳性菌的生长条件适宜，腐胺的含量迅速增加，第3天各组含量为31.53～39.34 mg/kg，随后腐胺含量增加缓慢。与对照组相比，复合香辛料提取物对腐胺的增加具有显著的抑制作用（P＜0.05）。发酵至第3天，处理组风干肠中的腐胺含量显著低于对照组（P＜0.05），且腐胺的含量随着复合香辛料提取物添加量的增加而显著降低（P＜0.05）。发酵结束时，复合香辛料提取物添加量为0.3 g/kg和0.5 g/kg的风干肠中腐胺含量差异性不显著（P＞0.05），但显著低于添加量为0.1 g/kg组（P＜0.05）。与腐胺含量变化趋势相似，添加复合香辛料提取物可以有效抑制尸胺的积累，且抑制效果随添加量的增加而增强（图1C）。而至发酵末期，添加量为0.5 g/kg的风干肠中尸胺的含量最低，为44.97 mg/kg，比对照组低19.65%。

组胺是发酵肉制品中最主要且毒性最大的生物胺之一[18]，人体摄入过量的组胺会引起血压降低和过敏性食物中毒[19]。由图1D可看出，发酵初期是组胺迅速积累的时期，至发酵第3天，各组组胺含量的范围为14.47～20.45 mg/kg，随后组胺的含量增加缓慢，至发酵末期，各处理组组胺含量均显著低于对照组，且添加量为0.5 g/kg的风干肠组胺含量显著低于添加量为0.3 g/kg组（P＜0.05）。组胺含量的增加量随着复合香辛料提取物添加量的增加而显著降低（P＜0.05）。发酵的前6 d是2-苯乙胺（图1E）和色胺（图1F）含量迅速积累的阶段，发酵后期，2-苯乙胺和色胺增加速度缓慢。添加复合香辛料提取物对2-苯乙胺和色胺的积累具有抑制作用，且抑制效果随着添加量的增加而增强，发酵末期，复合香辛料提取物添加量为0.5 g/kg的风干肠2-苯乙胺和色胺的含量显著低于对照组（P＜0.05）。

2.2 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠pH值的影响

由图2可以看出，随着发酵的进行，pH值呈逐渐下降的趋势。发酵初期由于优势菌乳酸菌代谢的产物乳酸促进了风干肠的pH值下降，发酵后期pH值下降速度减慢，这可能是因为微生物代谢产生的一些碱性物质如氨和三甲胺阻碍pH值的降低[20]。添加复合香辛料提取物组pH值下降的速率显著高于对照组（P＜0.05），说明复合香辛料提取物的添加可以促进风干肠pH值的降低，且添加0.5 g/kg组显著低于添加量为0.3 g/kg和0.1 g/kg组（P＜0.05）。pH值的降低也可以一定程度上抑制腐败菌的生长，从而抑制生物胺阳性菌的生长，降低生物胺的积累。与本研究结果相似，杨铭铎等[21]发现向肉馅中添加大蒜粉、白胡椒等混合香辛料可以刺激细菌产酸，促进发酵的完成，且随添加量的增加促进作用加强。

图2 不同添加量复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中pH值的变化Fig. 2 Changes in pH of sausages added with different amounts of spice extract during fermentation

2.3 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠水分含量和水分活度的影响

图3 不同添加量复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中水分含量（A）和水分活度（B）的变化Fig. 3 Changes in moisture content (A) and water activity (B) of sausages added with different amounts of spice extract during fermentation

如图3A所示，发酵初期（0～3 d），各组风干肠水分含量迅速下降，且各组风干肠之间差异性不显著（P＞0.05）。发酵至第6天，对照组水分含量显著高于各处理组（P＜0.05）。发酵结束时，添加复合香辛料提取物组水分含量低于对照组，且水分含量随着香辛料提取物的添加量的增加而降低，这有可能与pH值的变化有关；风干肠pH值降低会使肌肉蛋白发生变性，促进蛋白质凝胶化，降低蛋白持水性[22]。水分活度是指风干肠中水分蒸气压与纯水蒸气压的比值，指示的是风干肠中游离水的含量[23]。如图3B所示，不同处理组风干肠水分活度的变化趋势与水分含量的变化趋势相似，但下降速度不同。整个发酵过程中，对照组水分活度下降速度较慢，这可能与各组风干肠的pH值变化有关，pH值下降导致肌间水分游离出来，环境温度高，通风量大，自由水又不断向空气中扩散[24]。至发酵末期添加复合香辛料提取物组水分活度虽略低于对照组，但各组之间差异不显著（P＞0.05），复合香辛料提取物添加对风干肠水分活度变化影响不显著。

2.4 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠TBARS值的影响

图4 不同添加量复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中TBARS值的变化Fig. 4 Changes in TBARS value of sausages added with different amounts of spice extract during fermentation

TBARS值是影响产品风味的重要指标，如过高则有哈喇味出现[25]。如图4所示，随着发酵的进行，各组风干肠的TBARS值呈逐渐上升趋势，发酵初期，TBARS值增加速度较缓慢，这可能是由于此阶段是氧化初级产物大量积累的阶段，二级氧化产物积累还比较少，随后TBARS值迅速增加，说明此阶段脂肪氧化程度增加。发酵末期，对照组的TBARS值最大，高达0.67 mg/kg，添加复合香辛料提取物对风干肠的氧化具有一定的抑制作用，且添加量为0.5 g/kg组的TBARS值显著低于添加量为0.1 g/kg组（P＜0.05），即TBARS值增加量随着复合香辛料提取物添加量的增加而减少。与该研究相似，梅林琳[26]研究表明肉桂油在肉脯加工中具有很好的抗氧化作用；曹娟等[27]研究表明绿茶提取物可以将意大利发酵香肠中TBARS值降低20%左右。

2.5 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠微生物指标的影响

图5 不同添加量复合香辛料提取物风干肠在发酵过程中好氧菌总数（A）、乳酸菌总数（B）和肠杆菌总数（C）的变化Fig. 5 Changes in total aerobic bacterial count (A), lactic acid bacterial count (B) and Enterobacteriaceae count (C) in sausages added with different amounts of spice extract during fermentation

如图5A所示，发酵初期（0～3 d），由于肠体中营养丰富，条件适宜，各组风干肠好氧菌总数迅速积累，添加复合香辛料提取物组略低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。发酵中后期，对照组好氧菌总数显著高于添加量为0.5 g/kg和0.3 g/kg组（P＜0.05），且添加量为0.3 g/kg和0.5 g/kg两组差异不显著（P＞0.05）。这与复合香辛料提取物具有较好的抑菌效果有关，由于植物提取物可以进入细胞壁、线粒体以及细胞膜，且植物提取物具有疏水性的特点，它可以破坏细胞膜结构，使膜的渗透性增加，导致细胞的内容物外漏，杀死细菌[28]。如图5B所示，发酵初期（0～3 d），乳酸菌迅速增长成为风干肠中的优势菌，且至发酵第3 天，各组风干肠中乳酸菌总数差异性不显著（P＞0.05），发酵末期，乳酸菌的增加趋势缓慢，这可能是风干肠的pH值和水分活度过低抑制了乳酸菌的生长。至发酵结束时，对照组和复合香辛料提取物添加量为0.1 g/kg组风干肠中乳酸菌总数最低，且二者间差异性不显著（P＞0.05）；添加量为0.3 g/kg和0.5 g/kg两组风干肠中乳酸菌总数最高，二者差异性不显著（P＞0.05）。与本研究相似，Cai Luyun等[29]研究表明添加丁香、小茴香和绿薄荷的提取油到红鼓鱼片中，可以有效抑制其贮藏过程中嗜常温菌的生长。

肠杆菌具有较高的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶活性，容易产生尸胺和腐胺[30]，如图5C所示，随着发酵的进行，风干肠中肠杆菌总数呈逐渐下降的趋势，这可能是由于优势菌乳酸菌等产生乳酸使pH值迅速降低，或者分泌了细菌素等抑菌物质抑制了肠杆菌的生长。对照组肠杆菌降低趋势最为缓慢，添加复合香辛料提取物可以显著抑制肠杆菌的生长，且在发酵末期添加量为0.5 g/kg组显著低于添加量为0.3 g/kg组，添加量为0.3 g/kg组显著低于0.1 g/kg组（P＜0.05）；即肠杆菌的降低量随着复合香辛料提取物添加量的增加而增加，这与生物胺含量的测定结果相对应。因此添加植物提取物可以抑制肠杆菌等生物胺阳性菌的生长，从而抑制风干肠中生物胺的积累。

2.6 不同添加量复合香辛料提取物对风干肠感官评价得分的影响

表1 不同添加量的复合香辛料提取物发酵后的风干肠感官评价得分Table 1 Sensory evaluation of fermented sausages added with different amounts of spice extract

如表1所示，颜色方面各处理组得分显著高于对照组（P＜0.05），各处理组间差异性不显著（P＞0.05）。滋味和气味方面，复合香辛料提取物添加量为0.3 g/kg组风干肠获得最高得分，复合香辛料提取物添加量0.5 g/kg组香辛料味过浓不被评价者所接受，添加量为0.1 g/kg组由添加量过少，风干肠缺少特有的香味，风味不足。酸味方面，复合香辛料提取物添加量为0.3 g/kg和0.5 g/kg组风干肠获得了较高的得分，且二者差异性不显著（P＞0.05），这2 组风干肠的酸味处于消费者的接受范围。对于整体可接受性方面，复合香辛料提取物添加量为0.3 g/kg组风干肠获得了最高的得分。

3 结 论

添加复合香辛料提取物可以有效抑制风干肠发酵过程中6 种生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、组胺、2-苯乙胺和色胺）的积累，抑制TBARS值、好氧菌总数和肠杆菌总数的增加，且抑制效果随着复合香辛料提取物添加量的增加而增加；添加复合香辛料提取物一定程度上可以改善风干肠的感官品质，但添加0.5 g/kg复合香辛料提取物会使香辛料的味道过重，影响风干肠的感官品质，而添加0.3 g/kg复合香辛料提取物获得了最高的感官得分。综上所述，将0.3 g/kg复合香辛料提取物应用到风干肠的生产中，可以有效抑制风干肠中生物胺的积累，同时改善风干肠的感官品质。

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Inhibition of Mixed Spice Extract on Biogenic Amine Formation in Harbin Dry Sausage

SUN Qinxiu, DU Hongzhen, LI Fangfei, ZHENG Dongmei, KONG Baohua*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This study investigated the inhibitory effect of addition of different amounts (0.1, 0.3 and 0.5 g/kg) of mixed spice extract (from a 1:1:1 mixture of cinnamon, clove and star anise) on the formation of biogenic amines (BAs), as well as its inf l uence on the physicochemical, microbiological and sensory properties of Harbin dry sausage during fermentation.Results showed that the extract signif i cantly concentration-dependently inhibited the formation of BAs (tyramine, putrescine,cadaverine, histamine, 2-phenethylamine and tryptamine), and reduced the formation of thiobarbituric acid reactive substances and the growth of aerobic bacteriad (P ＜ 0.05). But addition of 0.5 g/kg the extract resulted in the appearance of an unacceptable fl avor. Therefore, adding 0.3 g/kg mixed spice extract into dry sausage was the best for inhibiting the accumulation of BAs and improving the sensory quality of sausage.

air-dried sausage; spice extract; biogenic amines; physicochemical properties; microbiological properties;sensory quality

10.7506/spkx1002-6630-201801003

TS251.5

A

1002-6630（2018）01-0022-07

孙钦秀, 杜洪振, 李芳菲, 等. 复合香辛料提取物对哈尔滨风干肠中生物胺形成的抑制作用[J]. 食品科学, 2018, 39(1):22-28.

10.7506/spkx1002-6630-201801003. http://www.spkx.net.cn

SUN Qinxiu, DU Hongzhen, LI Fangfei, et al. Inhibition of mixed spice extract on biogenic amine formation in Harbin dry sausage[J]. Food Science, 2018, 39(1): 22-28. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801003.http://www.spkx.net.cn

2016-09-25

国家自然科学基金面上项目（31471599）；“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401504）

孙钦秀（1989—），女，博士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail：sunqinxiugo@163.com

*通信作者简介：孔保华（1963—），女，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：kongbh@163.com