不同时期增生性瘢痕组织中c-kit、PI3K的表达变化

王宝云，唐修俊，王达利

(1遵义医学院附属医院,贵州遵义563000：2贵州省人民医院)

不同时期增生性瘢痕组织中c-kit、PI3K的表达变化

王宝云1,2，唐修俊1，王达利1

(1遵义医学院附属医院,贵州遵义563000：2贵州省人民医院)

目的探讨酪氨酸激酶受体(c-kit)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)在不同时期增生性瘢痕组织中的表达变化。方法临床收集增生性瘢痕(HS)患者HS组织24例份，随机分为6个月、12个月、24个月组，另选正常皮肤组织8例份作为对照组；行HE染色，应用RT-PCR技术检测 c-kit、PI3K mRNA表达水平，Western blotting法检测c-kit和PI3K蛋白表达水平。结果正常皮肤组组织中c-kit mRNA呈高表达，PI3K mRNA呈低表达。不同时段HS组织中PI3K、c-kit的mRNA表达：随时间延长HS组织中PI3K的mRNA表达由强变弱，早期(6、12个月组)呈高表达，晚期(24个月组)降低;其6个月及12个月组高于正常组(P均<0 05)；c-kit mRNA表达量由弱变强，在HS早期(6个月组)同正常皮肤组织相比呈现低表达(P<0.05)，12个月组逐渐升高， 24个月组高于12个月组(P<0.05)，仍低于正常组(P均<0.05)。正常皮肤组织c-kit蛋白和PI3K 蛋白呈低表达。各组不同时间c-kit、PI3K 蛋白表达均高于正常组，12个月组与24个月组两指标比较,P均<0.05。结论不同时期HS组织中c-kit、PI3K mRNA和蛋白质表达存在差异，除c-kit mRNA外，均高于正常皮肤组织。瘢痕增生明显时c-kit、PI3K mRNA和蛋白质表达增高，瘢痕稳定时逐渐降低。

增生性瘢痕；酪氨酸激酶受体;磷脂酰肌醇(-3)激酶

增生性瘢痕(HS)是组织过度增生形成的一种病理性瘢痕，是一种人类特有的纤维增生性疾病。作为整形外科常见疾病，一直是国内外学者研究的难点和热点。目前其发病机制仍不十分清楚。研究显示[1]，干细胞因子(SCF)和c-kit通过参与成纤维细胞增殖过程调控伤口愈合。c-kit是由显性白斑基因编码的酪氨酸激酶受体，与 SCF 受体结合，激活酪氨酸激酶，发生自身磷酸化并通过下游信号分子Akt、PI3K、c-kit，促进黑色素细胞、生殖细胞、造血干细胞等增殖与活化。c-kit还是SCF/c-kit系统下游信号传导通路中重要信号分子，该通路对细胞的生存、增殖起重要作用。Mukhopadhyay等[2]研究发现，用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼抑制阻断瘢痕疙瘩中SCF/c-kit信号通路上酪氨酸激酶，下游c-kit表达减少，使其产物α平滑肌肌动蛋白表达降低，由此可推断SCF/c-kit信号通路参与瘢痕的形成。c-kit 的蛋白产物 Akt激活后可启动下游 PI3K/Akt 信号通路调控细胞增殖[3]。因此，我们推测， SCF/c-kit 信号通路及其下游 PI3K/Akt通路也参与不同时期HS中瘢痕的形成。2011年1月～2014年12月，本课题通过收集6、12、24个月的HS组织, 检测c-kit、PI3K mRNA和蛋白在各时期瘢痕中的表达，探讨c-kit、PI3K是否参与HS形成，为HS的防治及靶向治疗提供前期基础研究理论。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集遵义医学院附属医院烧伤整形外科患者24例，男12例、女12例，年龄6～55岁、中位年龄34岁。瘢痕形成原因：胸前毛囊炎后HS 14例，烧伤后HS 6例，手术切口HS 4例。瘢痕组织无感染破溃，无其他肿瘤及器质性病变，患者及家属知情同意。选其6、12、24个月(6、12、24个月组)胸前及肩部未经过药物处理的HS组织，另收集8例健康无瘢痕体质患者相应部位正常皮肤组织作为对照组。健康无疤痕体质患者男4例、女4例，年龄2～55岁。

1.2 标本切取保存与HE染色 术区常规消毒，取瘢痕组织后生理盐水清洗，取瘢痕增生明显位置黄豆大小两块组织，完全浸入盛有RNAiso Plus EP管和干燥EP管中转移至实验室，-80 ℃冰箱保存备用。再取1块瘢痕组织用4%甲醛固定24 h，行病理学检查。 HS组织行HE染色(制作过程：取材→固定→HS 标本脱水透明→组织块浸蜡包埋→蜡块组织切片与贴片→脱蜡与染色→脱水与固定→显微镜下观察拍照记录保存图片)。

1.3 瘢痕组织中c-kit和PI3K mRNA表达的检测 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol法提取总RNA，并将mRNA反转录为cDNA。参照试剂盒说明书进行PCR扩增。引物序列：c-kit：F：5′GGAAAGAAGACAACGACACGC3′(产物长度122 bp)；R：5′GGGGTCAGGAATAAACCTCAAGT3′(产物长度122 bp)；PI3K：F：5′GGTGACTGTGTGGGACTTATTGA3′(产物长度114 bp)；R：5′CTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA3′(产物长度114 bp)；β-actin：F：5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′(产物长度186 bp)；R：5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′(产物长度186 bp)。反应条件：取反应体系20 μL：SYBR PREMIX EX TAQⅡ(2×)10 μL，上下游混合引物1.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，59 ℃退火 30 s，共进行40个循环；从 55 ℃开始，每 0.5 ℃采集 1 次荧光，1 次/10 s,共采集 81 次。取PCR 产物5 μL，加入TAE 电泳缓冲液+1.5%的琼脂糖凝胶，110 V、电泳20 min。PCR 结果的分析根据文献[4]进行。目的基因表达量以2-ΔΔCT表示。

1．4 瘢痕组织中c-kit和PI3K 蛋白表达的检测 采用Western blotting法。蛋白提取(取少量组织块剪碎后置于5 mL匀浆器中加入RAPA(含 10 μL PMSF)试剂1 mL进行匀浆，操作均在冰上进行；将裂解物移至 1.5 μL离心管中，4 ℃离心 5 min；取上清即为样品总蛋白)→蛋白含量测定(按照下表加样用于制作标准曲线)→SDS-PAGE 蛋白质电泳-转膜(制作“三明治”)→ 封闭(将转膜成功的 PVDF 膜置于 Western 封闭液中，水平摇床上封闭1 h)→ 一抗孵育与洗膜 →二抗孵育与洗膜→ECL 发光 → 曝光检测。结果的数据处理：X 光片经扫描仪扫描为图片，利用图像分析仪，检测杂交带上的灰度值。

2 结果

2.1 HS组织HE染色结果 HS组织HE染色镜下观察：瘢痕深部胶原纤维增厚，表现为排列不规则，呈波澜形或缠绕成绳索状，正常皮肤中逐渐消失。12个月HS组织中成纤维细胞增多，以血管周围及间质中较多；24个月HS组织成纤维细胞有所减少，间质中细胞数减少不明显，胶原排列不规则，较12个月瘢痕组织稀松。

2.2 不同时期瘢痕组织中c-kit及PI3K mRNA和蛋白的表达变化 正常皮肤中c-kit mRNA呈高表达，PI3K mRNA呈低表达。不同时段HS组织中PI3K、c-kit的mRNA表达：随着时间延长HS中PI3K的mRNA表达由强变弱，早期(6、12个月组)呈高表达，晚期(24个月组)降低;其6个月及12个月组高于正常组(P均<0 05)；c-kit mRNA表达量由弱变强，在HS早期(6个月组)同正常皮肤组织相比呈现低表达(P<0.05)，12个月组逐渐升高， 24个月组高于12个月组(P<0.05)，仍低于正常组(P<0.05)。正常皮肤组织c-kit蛋白和PI3K 蛋白呈低表达。各组不同时间组c-kit、PI3K 蛋白表达均高于正常组，12个月组与24个月组两指标比较,P均<0.05。

表2 各组瘢痕组织中c-kit、PI3K mRNA和蛋白表达比较

3 讨论

HS作为一种成纤维细胞异常增殖及胶原过度沉积性疾病，其发生和发展可能与细胞周期调节相关基因的异常表达有关。有研究证实，对HS早期异常表达的细胞周期相关基因进行干预，可有效控制HS发生和发展。但基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，真正发挥功能的蛋白质经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤调控才能形成[5]。在此过程中有许多因素会干扰遗传信息的传递，如microRNA可沉默靶基因，抑制其蛋白的合成，但并不影响基因的mRNA表达数量[6]。而细胞内许多蛋白质的功能，是通过动态的蛋白质翻译后修饰来调控的，蛋白质翻译后修饰过程有很多种，不是每种修饰都在发挥调节细胞周期的作用。因此有必要探讨不同阶段HS细胞周期相关基因、蛋白的表达以及反映蛋白功能执行情况的一致性，为对HS进行细胞周期的干预或基因治疗提供前期理论依据。

已有研究[7]证实，成纤维细胞是HS中的主要效应细胞，瘢痕中成纤维细胞过度增生可能与细胞间的信号传递有关。研究显示，SCF和c-kit在伤口愈合的过程中促进成纤维细胞增殖从而调控伤口愈合[8,9]。SCF/c-kit信号系统、PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖，在肿瘤的生长发育中起重要作用。又有研究发现，Akt、PI3K、c-kit赋予造血干细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞以及胃肠道Cajal间质细胞增殖与活化[10,11]。前期研究表明,SCF/c-kit信号传导通路通过PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→Cyclin D3→Rb→p42/p94完成细胞DNA合成信号的传递导致细胞周期G1期向S期转变从而介导细胞增殖[12],该通路对细胞的增殖分化起重要作用。细胞自身细胞因子如酪氨酸激酶生长因子、G蛋白、整合素及转化生长因子β1均能激活SCF/c-kit信号通路下游信号PI3K/Akt通路，PI3K活化产生第二信使肌醇脂物质，在PI(3，4，5)P3依赖性蛋白激酶1的辅助下激活Akt调控PI3K表达从而促进细胞的增殖与分化[13]。在正常皮肤组织中也有少量c-kit的表达。创面修复过程中SCF/c-kit信号通路激活，c-kit表达上调从而促进细胞的增殖与分化。研究显示,在HS成纤维细胞体外培养中阻断PI3K/Akt通路可使其下游产物表达减少，因此根据实验结果初步可以推断c-kit、PI3K参与HS形成，其表达变化与临床HS的临床表现相符合。

本实验RT-PCR结果显示,正常皮肤组织中c-kit的mRNA高于不同时期瘢痕组织中mRNA，可能与取材不是同一患者、个体差异、患者处于亚健康状态等因素有关，目的基因并不全部翻译出目的蛋白，对此现象在后续实验中进一步证实。24个月组PI3K的mRNA表达低于6个月组。6个月组PI3K的mRNA表达高于12个月组可能与早期多种因子共同激活促进PI3K的表达有关。而Western blotting结果显示,c-kit、PI3K蛋白表达12个月组高于6个月组，因此，我们推测PI3K、c-kit mRNA和蛋白的表达在6～24个月内随HS形成的时间呈动态变化，瘢痕处于增生期时，PI3K、c-kit mRNA和蛋白表达呈进行性增高，随着瘢痕进入稳定期后c-kit mRNA和蛋白的表达逐渐降低。其蛋白表达增高峰值与mRNA增高峰值不呈正相关，基因表达与蛋白翻译不同步，可能与6个月组c-kit、PI3K的mRNA部分未翻译为功能蛋白有关，也可能与多种因子无效刺激及翻译出有效目的蛋白的mRNA数量较少有关。结合临床表现12个月瘢痕已达高峰趋于稳定，c-kit、PI3K mRNA表达逐渐降低；24个月组c-kit mRNA降低，PI3K mRNA明显降低，与临床瘢痕的变化相符合。

综上所述，在不同时期HS组织中c-kit、PI3K mRNA和蛋白质表达存在差异，在瘢痕增生高峰时期存高表达状态，瘢痕稳定时逐渐降低，这种差异性与HS的临床变化相符合。在HS的相关基因的转录与翻译过程中，可能存在基因沉默或基因丢失，但这些并未影响基因的最终产物蛋白质的表达以及蛋白功能的执行，即这两个基因在HS的形成和发展过程中作用明显，在HS早期对这两个基因进行靶向干预，有可能会较好地控制HS的发生发展。

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2017-06-07)