富血小板血浆联合右归饮对骨质疏松模型大鼠的实验研究

高国卫 赵立来 童培建

[摘要] 目的 研究富血小板血漿（PRP）联合右归饮对大鼠骨质疏松性骨折的影响。 方法 8月龄SPF级SD雌性大鼠148只，随机分为4 组：空白模型组（K组）、右归饮组（Y组）、PRP组（P组）、联合组（L组）。K组不做处理，其中P组和L组于骨折造模术前眼眶采血，制备PRP，在骨折模型建立术中将PRP凝胶注入骨折端；Y组及L组给予右归饮灌胃。观察骨折端影像学以及病理组织学变化，比较四组骨折愈合情况。 结果 从Micro-CT的骨痂图可见Y组、P组及L组在骨折后同一时间点骨痂的骨量较K组高。定量分析得出，每个时间点都是L组BV及BV/TV最高。组织病理学观察可见各实验组较K组的骨痂生长有明显改善。免疫组织化学观察结果：Col2a1在L组和P组在骨折术后1周表现为中度阳性，术后2周为强阳性，术后4周与6周为弱阳性。Y组骨折术后1周、2周均表现为中度阳性，术后4周与6周为弱阳性，K组术后1周表现为中度阳性，2周和4周时表现为弱阳性，6周时表现为阴性。 结论 L组治疗大鼠骨质疏松性骨折较单纯的P组和Y组治疗效果更佳，能显著提高大鼠骨质疏松性骨折愈合质量，明显缩短骨折愈合周期。

[关键词] 骨质疏松；骨折愈合；右归饮；富血小板血浆

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）28-0042-05

[Abstract] Objective To study the effect of platelet-rich plasma（PRP） combined with Youguiyin on osteoporotic fractures in rats. Methods 148 8-month SPF female SD rats were randomly divided into four groups： blank model group （group K）， Youguiyin group （group Y）， PRP group （group P）， and combination group （group L）. No treatment was performed in group K. The blood of group P and group L was collected from the eyelids before fracture surgery to prepare PRP， and PRP gel was injected into the fracture end during the establishment of fracture model. Group Y and group L were given Youguiyin by gavage. The changes in imaging and histopathology at the fracture end were observed and the fracture healing of the four groups was compared. Results The osteotomy map of Micro-CT showed that bone mass of bone callus was higher in group Y， group P， and group L than that in group K at the same time after fracture. Quantitative analysis showed that the BV and BV/TV of group L was the highest at each time point. Histopathological observation showed that the growth of bone callus in the experimental group was significantly better than that in the group K. immunohistochemistry results showed that Col2a1 was moderate positive in the group L and P at 1 week after fracture， strong positive at 2 weeks and weak positive at 4 and 6 weeks after operation. Col2a1 in group Y was moderate positive at 1 and 2 weeks postoperatively and weak positive at 4 and 6 weeks postoperatively. Col2a1 in group K was moderate positive at 1 week postoperatively and weak positive at 2 and 4 weeks postoperatively， and negative at 6 weeks after surgery. Conclusion The treatment of osteoporotic fractures in group L is better than that in group P and Y in the treatment of osteoporotic fractures. It can significantly improve the quality of osteoporotic fracture healing in rats and significantly shorten the period of fracture healing.

[Key words] Osteoporosis； Fracture healing； Youguiyin； Platelet-rich plasma

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以低骨量和骨微细结构破坏为特征从而导致骨脆性和骨折风险增加的一种全身骨骼性疾病，骨微结构破坏是骨质疏松性骨折发生的直接原因[1]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）可释放多种生长因子，在细胞增殖、细胞分化、趋化作用和血管形成方面发挥重要作用，可促进干细胞向成骨细胞诱导分化，加速骨折愈合，目前已广泛应用于骨缺损、骨折不愈合及软组织疾病的治疗和研究[2-6]。右归饮作为温补肾阳的代表方剂，有学者[7]研究认为可调整内环境，减少骨吸收，促进骨形成，促使成骨-破骨耦联向成骨方向转化，从而增加骨容积，治疗骨质疏松症临床效果已得到学者认可。本实验将富血小板血浆联合右归饮作用于骨质疏松模型大鼠，并观察二者在大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中的协同治疗作用，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物

右归饮按照《景岳全书》方药组成：熟地9 g、山药6 g、山茱萸3 g、枸杞6 g、制附子9 g、肉桂3 g、甘草3 g、杜仲6 g。用传统方法先煎附子20 min，后加入其余药。由浙江省中医院中药制剂室提供。

1.2 实验动物

8月龄SPF级SD雌性大鼠148只，体质量（250±30）g，购买并饲养于浙江中医药大学实验动物中心，控制室温在25℃，湿度52%，标准大鼠饲料及饮用纯净水。适应性饲养1周后，造模后给药（实验时间2016年8月～2018年2月）。

1.3 富血小板血浆制备

PRP组和联合组大鼠于骨折造模术前眼眶采血3 mL，注入含有枸橼酸钠溶液的离心管中，采用Landsberg法[8]制备PRP。

1.4 分组与造模

1.4.1 分组 K组：空白模型组；Y组：右归饮组；P组：富血小板血浆（PRP）组；L组：右归饮联合PRP组。所有大鼠按照随机数字表法排序并平均分配于4个组内，每组37只，每个组分骨折术后2、4、6周3个时间点，每个时间点3只大鼠，剩余每组28只，每个组分4个时间点，分别是骨质疏松性骨折模型建立术后1、2、4、6周，每个时间点各7只。

1.4.2 去卵巢大鼠骨质疏松模型 腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg）麻醉，经背侧正中切口，行双侧卵巢切除并结扎相应营养血管，逐层缝合，术后给予肌肉注射青霉素针10万U/只，每日2次，连续3 d。

1.4.3 胫骨开放性骨折模型[9] 去卵巢术后3个月再次腹腔注射氯胺酮麻醉，取大鼠双侧胫骨前方备皮，大鼠仰卧位，用10号圆刀片在双侧胫骨结节皮肤沿纵轴做一长约1.5 cm 皮肤切口，显露胫骨结节及其远端胫骨，距胫骨结节下方5 mm处，取1 mmφ克氏针交叉鉆孔，组织剪锐性离断，用1 mmφ克氏针在断端髓腔内逆行内固定，逐层缝合。手术均在严格无菌条件下进行，常规肌肉注射青霉素针10万U/只，每日2次，连续3 d。

1.4.4 标本采集 大鼠断颈处死后，沿原切口显露胫骨及骨折部位，延长切口上至膝关节，下至踝关节。在踝、膝关节间隙平面横行剪断，完整取出胫骨标本，轻柔拔除克氏针。标本放入10%中性福尔马林溶液中浸泡3 d固定。

1.5 给药方法

1.5.1 右归饮给药 Y组及L组大鼠骨折造模术后给予右归饮灌胃，灌胃剂量根据体表面积换算公式A=k·W2/3，以60 kg 成人用药量及体表面积为参考标准，计算出动物用药剂量作为给药剂量。

1.5.2 富血小板血浆干预 根据分组情况，在大鼠双侧胫骨近端骨折模型建立术中将预先制备好的PRP凝胶注入骨折端。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 Micro-CT 扫描及三维重建分析[10] 将术后1、2、4周的胫骨骨折标本行骨痂局部micro-CT 扫描及骨折部位与周边骨三维重建分析。每组图片在同一条件下进行3-D重建，并用μCT系统的评估软件进行形态计量学分析，着重测量骨性骨痂体积（BV）和骨性骨痂体积百分比（BV/TV %）。

1.6.2组织形态学观察[11] ①苏木精-伊红染色（hematoxylin & eosin stain，HE染色）双侧胫骨骨折标本放入10%NBF中浸泡3 d予充分固定。固定后用去离子水冲洗3～5次，然后用14%EDTA溶液脱钙处理6～8周，每隔2～3 d换液。脱钙完成后，同样用去离子水冲洗3～5次，然后经硬化全自动脱水处理后用石蜡包埋。切片时，骨折线与刀片呈水平位，以3 μm厚度切片。烤片后进行染色。在光学显微镜下观察。②Col2a1免疫组化观察（Stre-ptavidin-peroxidaseconjugtate-method，S-P染色）标本均经中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋、切片。按S-P 免疫组化试剂盒说明书进行操作。显微镜下观察染色结果。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用配对t检验。每组数据均进行正态分布检验，数据有效性检验均采用双侧检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Micro-CT 分析结果

从Micro-CT的骨痂见封三图8～10，Y组、P组及L组大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量较K组高，第4周时P组及L组骨痂骨量明显高于K组和Y组。Micro-CT软件的定量分析结果中可见，L组、P组、Y组骨性骨痂体积（BV）及骨性骨痂和总骨量的体积比（BV/TV）在术后第1、2、4周均高于K组，每个时间点L组BV均最高，其中术后第1、2、4周组间两两比较有统计学差异（P<0.05），见表1～2。

2.2组织形态学结果

HE染色结果见封三图11。（1）骨折术后1周，由于骨折创伤刺激，吸引了大量细胞聚集在断端周围形成纤维骨痂，可见间充质细胞、成纤维细胞和炎性细胞；同时，有大量新生毛细血管出现；断端附近骨外膜下可见间充质细胞增殖，开始分化为软骨细胞，L组骨外膜可见分化较少的成骨细胞，形成原始小梁状骨，Y组、P组骨外膜下以软骨细胞为主，P组较Y组稍多，K组纤维性骨痂稀疏，毛细血管较少，断端血肿机化迟缓，骨外膜下软骨细胞数量最少。（2）骨折术后2周，软骨性骨痂形成以取代纤维骨痂，软骨痂周边部软骨细胞肥大，部分变性坏死，可见少量原始小梁状骨，L组原始小梁状骨表面可见大量排列整齐的成骨细胞，软骨痂周边开始出现网织骨，P组原始小梁状骨表面成骨细胞数量较多，排列相对整齐，而Y组成骨细胞数量较少，排列杂乱，原始骨小梁间为结缔组织；K组见毛细血管数量增多，骨外膜下间充质细胞增殖分化为较多的软骨细胞和较少的成骨细胞。（3）骨折术后4周，L组软骨痂周边逐渐被网织骨取代，软骨性骨痂转变为骨性骨痂，早期形成的原始小梁状骨内软骨细胞逐渐分化为骨细胞；与此同时，表面出现的破骨细胞与成骨细胞“耦合”，原始骨小梁逐渐改建为成熟骨小梁。与L组相比，P组成熟骨小梁数量少，软骨细胞较多，Y组小梁状骨吸收快，骨小梁间距增宽，K组原始小梁状骨表面成骨细胞数量较多，排列相对整齐，软骨痂周边开始出现网织骨。（4）骨折术后6周，K组软骨性骨痂已逐渐被骨性骨痂取代。L组骨性骨痂继续经破骨细胞和成骨细胞相关作用，在主应力方向上形成更多的网织骨，在应力轴线以外，破骨细胞相对活跃，多余的骨痂逐渐被吸收、清除，髓腔重新贯通，与L组相比，P组、Y组骨痂塑形相对较慢。

Col2a1免疫组化结果见封三图12。（1）Col2al 位于细胞浆中，胞浆染色呈棕黄色为阳性细胞，无阳性细胞或阳性细胞比例<10%为阴性，阳性细胞比例10%～30%为弱阳性，阳性细胞比例30%～60%为中度阳性，阳性细胞数>60%为强阳性[12]。（2）四组大鼠骨痂标本在骨折术后第1、2周均比第4、6周有高表达，其中L组和P组在骨折术后1周表现为中度阳性，术后2周为强阳性，术后4周与6周为弱阳性。Y组骨折术后1周、2周均表现为中度阳性，但2周时单个视野阳性细胞计数要高于第1周，术后4周与6周为弱阳性，6周时单个视野阳性细胞计数低于4周，相比P组和L组同一时间节点，Y组单个视野阳性细胞计数较低。K组术后1周表现为中度阳性，2周和4周时表现为弱阳性，6周时表现为阴性，但1周及2周时单个视野阳性细胞计数要低于Y组、P组和L组。

3讨论

目前对骨质疏松性骨折愈合是否与青壮年骨折愈合的机制一样尚不清楚，所以临床上治疗骨质疏松性骨折均采用与一般性骨折相同的方法与原则，常忽视其骨质疏松的病理特点，这样不但疗效难以提高，而且易发生骨折愈合不良或再次骨折[13]。由此，学者们开始探索骨质疏松性骨折的愈合特点，梁祖建等[14]认为，骨折早期，骨愈合的启动过程与青壮年骨折相同，8～12周时骨质疏松性骨折骨吸收仍较旺盛，骨矿化相对较少，胶原纤维形成不足，骨痂成熟及骨形成迟缓。其形态学特征是软骨内成骨与膜内成骨共同参与了骨质疏松性骨折的修复[15]，且以软骨内成骨为主，但软骨内成骨过程较慢，板层骨形成迟缓，胶原排列紊乱，骨小梁纤细，破骨细胞活跃，软骨性骨痂发育为成熟骨痂迟缓，骨痂质量差。闫景龙等[16]以卵巢摘除大鼠和老年大鼠作为雌激素缺乏型和增龄型两种骨质疏松的动物模型，从组织形态学等多方面对骨质疏松性骨折愈合的特点进行分析，提出软骨内成骨延缓是骨质疏松性骨折愈合的共同本质特征，同时发现外源性生长激素对骨折愈合具有明显的促进作用。本实验希望通过富血小板血浆联合右归饮促进骨质疏松性骨折愈合，并能缩短愈合周期及提供愈合质量。

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）通过离心获得，高于生理浓度数倍的血小板血浆，通过释放多种生长因子，发挥修复作用。PRP促进骨再生的作用在许多骨缺损的动物模型和临床应用上得到了验证[17-19]。创伤修复过程就是炎症细胞和修复细胞以有规律而又协调的方式参与愈合过程[20]。主要的炎症细胞包括中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞等，修复细胞包括成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮细胞等，PRP含有的各种生长因子通过趋化作用、合成分泌作用和分化增殖作用来发挥生物学效应，来促进这些细胞的增殖、分化[21]。不同的细胞对不同的因子起反应，使各种细胞具有各自的修复过程[22]。PRP中最主要的成分是血小板、白细胞和纤维蛋白。PRP在使用中可以是液态的，便于注射，如膝关节腔注射、网球肘痛点注射等；也可以与凝血酶原合用，激活后成凝胶状，便于粘合骨块、填塞创腔、覆盖创面和防止生长因子流失。如与凝血酶合用，血小板会迅速被激活，10 min内即开始释放生长因子，1 h内能释放出95%的生长因子[23]。这些生长因子与周围修复细胞上的受体结合，经过信号通路传至细胞核，刺激细胞分化和增殖。不过，由于血小板激活后释放的生长因子种类较多，生长因子的作用方式，特别是生长因子之间如何相互作用，有待进一步深入研究。虽然PRP促进骨折愈合的作用在动物和临床研究中得到了认可，但并未发现学者将PRP应用于骨质疏松性骨折愈合方面的实验和临床研究，可能是认为骨质疏松性骨折与一般成人骨折愈合过程相同。本实验结果显示：①Micro-CT的骨痂圖中可见P组大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量较K组高，第4周时P组骨痂骨量明显高于K组和Y组。Micro-CT软件的定量分析结果中可见，P组骨性骨痂体积（BV）及骨性骨痂和总骨量的体积比（BV/TV）在术后第1、2、4周均比K组高。CT定量分析与影像学表现相符。②HE染色结果：骨折术后1周，P组骨外膜下以软骨细胞为主，P组较Y组稍多；骨折术后2周，P组原始小梁状骨表面成骨细胞数量较多，排列相对整齐，而Y组成骨细胞数量较少，排列杂乱，原始骨小梁间为结缔组织；骨折术后4周，与L组相比，P组成熟骨小梁数量少，软骨细胞较多；骨折术后6周，与L组相比，P组骨痂塑形相对较慢。③Col2a1免疫组化结果：P组大鼠骨痂标本在骨折术后第1、2周均比第4、6周有高表达，P组在骨折术后1周表现为中度阳性，术后2周为强阳性，术后4周与6周为弱阳性。

右归饮作为温补肾阳的代表方剂，最早载于张景岳的《景岳全书》。近年来学者对其治疗骨质疏松的机制和临床疗效进行了深入研究，童培建等[24]认为右归饮能调整骨生存内环境，能促进成骨细胞增殖，可增加骨容积。周华[25]认为右归饮能明显增强BMP-2的表达，增加成骨细胞数量，从而加速骨形成，具有治疗骨质疏松的作用。钱康[26]研究得出右归饮可以提高血清碱性磷酸酶和雌二醇水平，提示右归饮可能通过拮抗雌激素降低和促进成骨细胞增殖改善骨质疏松。罗汉文等[27]认为，右归丸能有效调节去卵巢大鼠垂体-肾上腺轴的功能状态和病理变化，从而促进骨生成，抑制骨吸收，达到治疗骨质疏松的目的。因此本实验选择右归饮作为实验对照组（Y组）：①从Micro-CT的骨痂图中可见，Y组大鼠在骨折后不同周期骨痂的骨量较K组高，定量分析结果中可见，Y组BV和BV/TV%在术后第1、2、4周均比K组高。②HE染色结果：骨折术后1周，Y组骨外膜下以软骨细胞为主；骨折术后2周，Y组成骨细胞数量较少，排列杂乱，原始骨小梁间为结缔组织；骨折术后4周，Y组小梁状骨吸收快，骨小梁间距增宽；骨折术后6周，与L组相比，Y组骨痂塑形相对较慢。③Col2a1免疫组化结果：Y组骨折术后1周、2周均表现为中度阳性，但2周时单个视野阳性细胞计数要高于第1周，术后4周与6周为弱阳性，6周时单个视野阳性细胞计数低于4周，相比P组和L组同一时间节点，Y组单个视野阳性细胞计数较低。

本实验联合富血小板血浆与右归饮作用于大鼠骨质疏松性骨折，实验结果显示：①Micro-CT的骨痂图中可见，在骨折术后不同阶段，L组均较K组、Y组骨折愈合快，骨痂生长及塑形好；CT定量分析L组、P组、Y组骨性骨痂体积（BV）和骨性骨痂和总骨量的体积比（BV/TV%）在术后第1、2、4周均比K组高，每个时间点都是L组BV最高，其中术后第1、2、4周组间两两比较有统计学差异（P<0.05）。②组织形态学结果提示L组在骨折术后相同时间节点，软骨细胞数量较P组、Y组、K组多，原始小梁状骨及网织骨出现早，骨痂塑形好，髓腔贯通。③软骨及成骨、破骨细胞相关的基因表达，软骨分化标准基因Col2a1在L组大鼠中骨折术后第1、2周的表达水平均比其他三组明显增高，第1周时达到峰值，成骨相关的标志基因Runx2、BMP2 和Osteocalcin，在骨折愈合后期阶段（术后4～6周），L组明显高于其他三组。破骨细胞相关基因Rankl和Opg基因的表达水平在术后2、4周时，L组较K组高，但与P组、Y组相比差异不明显，到术后第6周时破骨细胞相关基因表达水平明显高于其他三组。提示L组软骨内骨化出现早，且骨化质量高，在骨折后期骨性骨痂生成最多，同样在骨折愈合后期骨痂塑形最为满意，与组织形态学结果相符。以上实验结果证实PRP联合右归饮治疗的疗效较单纯的右归饮及单纯的PRP治疗效果更佳，提示联合治疗能显著提高大鼠骨质疏松性骨折愈合质量，明显缩短骨折愈合周期，充分验证了PRP联合右归饮在治疗骨质疏松性骨折愈合过程中的协同作用。

[参考文献]

[1] Legrand E，Audran M，Guggenbuhl P，et al. Trsbecular bone microarehitecture is related to the number of risk factors and etiology in osteoporotie men[J]. Microsc Res Tech，2007，70（11）：952-959.

[2] 吴开泽，陈献聪，康禹，等.富血小板血浆在膝关节骨关节炎治疗中的应用[J]. 国际骨科学杂志，2015，（6）：414-418.

[3] Foster TE，Puskas BL，Mandelbaum BR，et al. Platelet-rich plasma：From basic science to clinical applications[J].Am J Sports M Med，2009，37（11）：2259-2272.

[4] Anitua E， Sánchez M， Orive G， et al. The potential impact of the preparation-rich in growth factors（PRGF） in different medical fields[J]. Biomaterials，2007，28（31）：4551-4560.

[5] Bouletreau PJ，Warren SM，Spector JA，et al. Factors in the fracture microenvironment induce primary osteoblast angiogenic cytokine production[J]. Plast Reconstr Surg，2002，110（1）：139-148.

[6] Lohela M，Bry M，Tammela T. VEGFs and receptors involved in angiogenesis versus lymphangiogenesis[J]. Curr Opin Cell Biol，2009，21（2）：154-165.

[7] 李涯松，童培建，馬红珍，等. 健脾、补肾方药对老龄大鼠骨质疏松防治作用的实验研究[J]. 中国骨质疏松杂志，2003，（2）：167-170.

[8] Landesberg R，Roy M，Glickman RS，et al. Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation discussion[J]. Oral Maxillofac Surg， 2000，58（3）：297-300.

[9] 徐自胜，李孝林，任伯绪.兔胫骨骨折模型的不同固定方法[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011，（33）：6103-6106.

[10] Mi M，Jin H，Wang B，et al. Chondrocyte BMP-2 signaling plays a critical role in bone fracture healing[J]. Gene，2013，512：211-218.

[11] Cramer JA，Gold DT，Silverman SL，et al. A systematic review of persistehce and compliance with bisphosphonates for osteoporosis[J]. Osteoporos Int，2007，18（8）：1023-1031.

[12] Gupta G，Aronow WS. Treatment of postmenopausal osteoporosis[J]. Compr Ther，2007，33（3）：114-119.

[13] Goldhahn J，Suhm N，Goldhahn S，et al. Influence of osteoporosis on fracture fixation-A systematic literature review[J]. Osteoporos Int，2008，19（6）：761-772.

[14] 梁祖建，莊洪，刘忠厚，等. 青壮年骨折与骨质疏松性骨折愈合机理及药物促愈机制研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志，2009，15（9）：697-702.

[15] 郝永强，戴尅戎. 骨质疏松性骨折愈合的细胞超微结构观察[J]. 中华骨科杂志，2004，11（24）：670-673.

[16] 闫景龙，戴克戎，赵雅君，等. 卵巢切除对大鼠皮质骨结构和力学性能的影响[J]. 中国骨质疏松杂志，2001， 7（1）：22-24，17.

[17] 程文俊，金丹，赵艳，等. PRP对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响[J]. 中国修复重建外科杂志，2007， 21（4）：386-389.

[18] Mariano R，Messora M，de Morais A，et al. Bone healing in critical-size defects treated with platelet-rich plasma：A histologic and histometric study in the calvaria of diabetic rat[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radial Endod，2010，109（1）：72-78.

[19] 邓勇，葛建华，鲁晓波. PRP对骨折愈合影响的研究进展[J]. 西南军医，2012，14（2）：345-347.

[20] Ghanot S，Alex JC. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery[J]. Facial Plast Surg，2002，18（1）：27-33.

[21] 张绍伟，刘晶，韦纪英. 不同浓度富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖活性的影响[J]. 陕西医学杂志，2009，（6）：651-654.

[22] Zachos TA，Bertone AL. Growth factors and their potential therapeutic application for healing of musculoskeletal and other connective tissues[J]. Am J Vet Res，2005，66（4）：727-738.

[23] Alsousou J，Thompson M，Hulley P，et al. The biology of platlet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery：A review of the literature[J]. J Bone Jiont Surg Br，2009，91（8）：987-996.

[24] 童培建，金红婷，何帮剑，等. 干细胞介入治疗股骨头缺血性坏死的实验研究[J]. 中华骨科杂志，2010，30（6）：600-606.

[25] 周华. 右归饮对去势大鼠骨中BMP-2含量及相关因素影响的实验研究[J]. 中华中医药学刊，2008，26（4）：830-831.

[26] 钱康. Omega3多不饱和脂肪酸联合右归饮对骨质疏松模型大鼠的实验研究[J]. 中国中医急症，2013，22（8）：1361-1363.

[27] 罗汉文，关宏刚. 右归丸对骨质疏松模型大鼠垂体.肾上腺轴影响的实验研究[J]. 贵阳中医学院学报，2006，28（2）：60-62.

（收稿日期：2018-05-09）