川崎病冠状动脉损害和血管内皮微粒、一氧化氮及炎症因子变化相关性研究

仇慧仙 何跃娥 荣星

[摘要] 目的 通过检测川崎病患儿血内皮微粒、一氧化氮及炎症因子水平，探讨内皮微粒在反映川崎病早期血管功能状态作用及其影响因素。 方法 收集川崎病急性期患儿50例，同时收集性别、年龄相匹配的健康儿童20例，检测血内皮微粒、一氧化氮及炎症因子水平，观察内皮微粒和川崎病冠状动脉损害及炎症因子、一氧化氮水平间的关系。 结果 川崎病患儿血浆内皮微粒含量明显高于正常对照组，且有冠状动脉损害者升高水平更为明显，与一氧化氮及炎症因子肿瘤坏死因子-α、C-反应蛋白水平呈正相关（P<0.05）。 结论 川崎病患儿早期即存在EMPs的升高，与冠脉损害间呈正向关系，可反映川崎病患儿早期的血管功能状态，且与炎症因子及一氧化氮水平呈正相关。

[关键词] 川崎病；内皮微粒；一氧化氮；肿瘤坏死因子-α

[中图分类号] R725.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）28-0008-04

[Abstract] Objective To explore the role of endothelial microparticles in the vascular function of early Kawasaki disease and its influencing factors by detecting the levels of endothelial microparticles， nitric oxide and inflammatory factors in children with Kawasaki disease. Methods A totally of 50 children with acute Kawasaki disease were enrolled. 20 healthy children with matched gender and age were collected. The blood endothelial microparticles， nitric oxide and inflammatory factors were measured. The relationship between endothelial particles and Kawasaki disease coronary artery lesions， inflammatory factors and nitric oxide were observed. Results The plasma endothelial microparticles content of children with Kawasaki disease was significantly higher than that of the normal control group， and the elevated level of coronary artery lesions in the patients was more obvious， and positively correlated with the levels of nitric oxide， inflammatory factors tumor necrosis factor-α and C-reactive protein（P<0.05）. Conclusion The elevation of EMPs occurs in early Kawasaki disease and is positively correlated with coronary artery lesions， which can reflect the vascular function status of children with early Kawasaki disease and is positively correlated with inflammatory factors and nitric oxide levels.

[Key words] Kawasaki disease；Endothelial microparticles；Nitric oxide；Tumor necrosis factor-α

川崎病（Kawasaki disease，KD）是目前兒童最常见的获得性心脏病之一，患儿的血管内皮功能障碍及冠状动脉损害是动脉粥样硬化发生的第一步，也是成年后发生心血管疾病的潜在危险因素[1]，而目前临床缺乏简便可行的方法反映川崎病患儿的内皮功能状态。内皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）是细胞在活化损伤或凋亡时从细胞表面脱落的小的膜性囊泡，是一种亚细胞结构，其中直径小于1 μm的微粒命名为EMPs，EMPs被认为是内皮功能障碍的指标[2]。有研究发现，川崎病患儿的血浆EMPs水平明显升高，与冠状动脉损害呈正相关[3]。一氧化氮（nitric oxide，NO）在川崎病内皮损害中起关键作用[4]。川崎病患儿内皮功能障碍导致EMPs升高是否也与NO有关，目前国内尚未见报道。本研究通过检测川崎病患儿血浆中EMPs、NO浓度及炎症因子水平，观察川崎病患儿中早期EMPs水平与川崎病冠状动脉损害、NO及炎症反应间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年6月～2016年6月在我院确诊为川崎病组患儿50例，女17例，男33例，平均年龄（29.7±18.8）个月，入院时平均发热时间（6.0±2.8）d，均符合2004 年美国儿科学会和心脏病学会联合制定的川崎病诊断标准。另选取同期性别、年龄匹配的健康儿童20例作为正常对照组，女7例，男13例，平均年龄（36.8±14.3）个月，两组间性别构成及年龄比较差异无统计学意义（χ2=0.006，P=0.937，t=-1.71，P=0.094）。川崎病组50例患儿中，以病程1个月内是否存在冠状动脉损害分成冠状动脉损害（coronary artery leision，CAL）组14例（28%）；冠状动脉无损害（no coronary artery leision，NCAL）组36例。

冠状动脉扩张的诊断标准：年龄<3岁，冠状动脉直径>2.5 mm；3岁≤年龄<9岁，冠状动脉直径>3.0 mm，9岁≤年龄<14岁，冠状动脉直径>3.5 mm。

1.2 方法

1.2.1 检测患儿血浆EMPs、NO及TNF-α含量 同时收集川崎病组患儿的临床及实验室资料，如患儿年龄、发热时间（发热开始至入院时的时间）、丙球使用时间（病程开始至丙球使用的时间间隔）、血白细胞（white blood cells，WBC）计数、中性粒细胞绝对值（absolute neutrophil count，ANC），C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、有无冠脉损害。

1.2.2 流式细胞仪测定血浆内皮微粒 所有患儿抽取静脉血2 mL（川崎病患儿在静脉丙球使用前），先后以160 g 离心10 min 和1 000 g 离心8 min获取无血小板血浆。取50 μL无血小板血浆，加入4 μL PE 标记的小鼠抗人CD31 单克隆抗体（mAb）和FITC 标记的小鼠抗人CD42b mAb，室温下避光孵育20 min；依次加入1 mL PBS 液和已知浓度的1.0 μm（用于前向角设门）和10.0 μm（用于计数参照） 标准微球混合液后上流式细胞仪检测，定义EMP直径<1.0 μm，收集10000个10.0 μm 标准微粒用于计数参照标准。

1.2.3 硝酸还原法检测血浆NO水平 于急性期清晨空腹取外周静脉血2 mL，EDTA 抗凝，2500 r/min，离心半径15 cm，离心3 min后分离血浆和细胞，-70℃保存。采用硝酸还原法测定血浆NO 水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 ELISA法检测血浆TNF-α含量 留取患儿血清标本，采用ELISA法检测血TNF-α含量，严格按试剂盒操作步骤进行操作。

1.3 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用（x±s）表示，多组间比较如符合正态性分布且方差齐，采用单因素方差分析并采用LSD法进行两两比较，如不符合正态分布或方差不齐，采用Kruska-Wallis 秩和检验；计数资料采用χ2检验；相关性检验采用直线相关分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间血浆EMPs、NO及TNF-α水平比较

川崎病（KD）组患儿血浆EMPs、NO及TNF-α水平均较正常对照组明显升高，且冠脉损害组升高幅度更为明显（P<0.05），见表1。

CAL组和NCAL组比较，CAL组白细胞及中性粒细胞绝对值、ESR、EMPs、NO及TNF-α水平较NCAL组升高，差异有统计学意义（P<0.05），CAL组CRP水平较NCAL组高，但两者差异无统计学意义（P>0.05），两组间患儿年龄、發热时间及丙球使用时间无差异（P>0.05）。见表2。

2.2相关性分析

EMPs与NO、CRP、TNF-α间均呈正相关（r分别为0.336、0.397、0.614，P分别<0.01、0.004、<0.01），见图1。

NO与白细胞及中性粒细胞计数间呈正相关（r=0.383、0.467，P=0.006、0.001），见图2。

3讨论

川崎病是一种全身血管炎性疾病，其中冠状动脉损害是其严重并发症之一[5]。急性期冠状动脉病变发生率可高达30%[6]，而冠状动脉病变及血管内皮的持续损害是成年后冠状动脉粥样硬化的潜在危险因素，但目前临床缺乏有效的检测血管内皮的指标。完整的血管内皮屏障在调节血管功能和内环境稳定方面起着重要的作用，内皮的激活或损伤导致多种因子紊乱，其中包括微粒的释放。EMPs是内皮细胞受到各种刺激后从细胞膜上脱落下来的一个亚细胞组分，被认为是内皮功能障碍的指标[7-9]，在炎症、凝血及血管功能等方面均有一定的影响[10-13]。在一些内皮功能受损的疾病如白塞氏病、系统性红斑狼疮等疾病中均存在EMPs不同程度的升高[14，15]。目前普遍认为EMPs 的出现会形成恶性循环，即内皮功能受损引起EMPs释放增加，增加的EMPs反过来会进一步诱导内皮功能不全，加重病情[16]。Tual-Chalot等[17]研究提示缺氧条件下产生的EMPs通过调节一氧化氮合酶的磷酸化水平，抑制了NO的合成，损伤内皮舒张功能。研究发现KD患儿出现EMPs的升高，升高的EMPs对血管内皮功能的影响是否也和NO水平有关？本实验通过检测50例急性期KD患儿及20例性别年龄相匹配的正常儿童的EMPs、NO含量及炎症因子水平，探讨其相关性。

结果显示，KD患儿血浆EMPs水平较正常儿童明显升高，而存在冠状动脉损害的KD患儿EMPs升高水平更为明显。因KD为全身中小血管的炎症，存在冠脉损害的患儿提示血管炎症更为明显，故EMPs升高得更为明显。因而KD患儿早期EMPs明显升高的患儿需高度警惕出现冠状动脉损害可能，可能为冠状动脉损害的危险因素之一。此外我们还发现，EMPs水平和炎症因子CRP、TNF-α间呈正相关，提示炎症反应可加重内皮功能损害从而促进内皮细胞释放EMPs。

NO是体内由L精氨酸在NO合酶作用下产生的一种气体信号分子，生理条件下具有降血压，抑制血小板黏附、聚集、抗血栓、抑制细胞的增生、保护细胞等作用，但高浓度NO可引起血管壁炎症的发生，导致冠状动脉扩张、内膜增厚、管腔狭窄，与许多心血管疾病密切相关[18]。所以 NO 的作用是一种矛盾存在，具体的作用可能与其浓度、产生部位、作用的持续时间等因素有关[19]。有文献报道，KD中存在诱导型一氧化氮合酶及NO水平变化，在冠状动脉病变中发挥一定的作用[20]。本实验结果显示，KD急性期患儿血浆NO含量明显高于正常对照组，且冠状动脉损害组患儿升高水平更为明显，与白细胞、中性粒细胞计数水平呈正相关。急性期KD患儿外周血中NO表达上调，可能和中性粒细胞升高使一氧化氮合酶合成增加，从而使血浆NO水平升高，提示其可能参与KD早期炎症性变化以及冠状动脉的损伤过程。

相关性分析显示，KD患儿血EMPs水平与NO、CRP及TNF-α呈正相关，炎症反应越强烈，发生冠脉损害及血管内皮功能损害的可能性越大，EMPs的含量越高。EMPs和NO两者在川崎病的冠脉损害发病中发挥协同作用。另KD冠脉病变检出率最高的是病程2～4周，本组资料KD患儿在平均病程为6 d时检测EMPs，即在出现冠脉扩张之前即可能存在血管功能异常，因此EMPs可作为KD患儿早期的血管功能状态的判断指标。但本实验仅观察了KD急性期患儿的血EMPs、NO水平变化及和炎症因子间的关系，未对恢复期进行分析，且EMPs和NO间具体的作用机制尚不明确，有待进一步相关研究。

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（收稿日期：2018-06-01）