咖啡因对早期胚胎及卵黄膜发育的影响

高原 邹鹏

[摘要] 目的 初步探索研究妊娠期妇女摄入咖啡因，对胎儿发育速度所造成的影响，以及其发生的机制。 方法 该研究在2016年5月—2017年6月以鸡胚为实验模型，分为正常组（PBS）、低剂量组（4 μmol/egg）、中剂量组（8 μmol/egg）、高剂量组（16 μmol/egg）。新鲜种鸡蛋分组后37℃孵化2 d，在蛋壳上开窗，给予不同剂量的咖啡因，继续培养6 d后取出胚胎固定。随后根据需要进行形态学与分子学方面的分析胚胎发育的变化。 结果 各个组别的卵黄膜形态发育明显不同，H.E染色可以进一步证实，并且p185 RT-PCR的表达明显受到影响，卵黄膜组织的细胞增殖和凋亡也出现了明显变化并出现凋亡。 结论 妊娠期妇女早期大剂量的摄入咖啡因，通过影响胎盘绒毛的发育影响营养物质的吸收从而影响到胚胎的正常发育。

[关键词] 咖啡因；胚胎；卵黄囊；胎盘

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）09（b）-0029-03

[Abstract] Objective To explore the effects of caffeine intake in pregnant women on the developmental speed of the fetus and its mechanism. Methods In this study， chicken embryos were used as experimental models from May 2016 to June 2017. They were divided into normal group （PBS）， low dose group （4 μmol/egg）， medium dose group （8 μmol/egg）， high dose group （16 μmol/egg）. Freshly bred eggs were incubated at 37 °C for 2 days， and windows were opened on the eggshells， and different doses of caffeine were administered. After 6 days of culture， the embryos were removed and fixed. Morphological and molecular aspects of subsequent changes in embryonic development were then performed as needed. Results The morphological development of yolk membrane was significantly different in each group. H.E staining could be further confirmed， and the expression of p185 RT-PCR was significantly affected. The cell proliferation and apoptosis of yolk membrane tissue also showed obvious changes and apoptosis. Conclusion Early intake of large doses of caffeine in pregnant women affects the normal development of embryos by affecting the development of nutrients in the development of placental villi.

[Key words] Caffeine； Embryos； Yolk sac； Placenta

出生時体重低于2 500 g，身长低于45 cm，孕周少于37周的新生儿称为低体重儿。低体重儿出生后由于皮下脂肪少，保温能力差，呼吸机能和代谢机能都比较弱，造成其死亡率较正常的新生儿高出很多，同时也会造成其智力发育方面的影响[1-2]。瑞典萨尔格林斯卡大学医院的研究小组在最新一期《BMC医学》杂志上发表论文指出，妊娠期妇女饮用咖啡可能导致孕期延长和造成低体重儿的风险增加。因此，研究者呼吁对孕期咖啡因推荐摄入量做出相应调整，深入研究咖啡因对胚胎发育的影响，不仅有治疗学意义，还能为生活保健提供科学的指导[3-5]。该研究在2016年5月—2017年6月选取新鲜的种蛋，每组20只共80只，探讨咖啡因对早期胚胎及卵黄膜发育的影响效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

种蛋：华南农业大学； 咖啡因：Sigma； 甲醛：天津化学试剂厂；P185引物：赛默飞。

1.2 胚胎的培养

横向孵化种蛋2 d，分组为：正常组（PBS）、低剂量组（4 μmoL/egg）、中剂量组（8 μmoL/egg）、高剂量组（16 μmoL/egg），随后开窗给予咖啡因，重新封闭蛋壳，继续培养6 d后取出鸡胚和卵黄膜，鸡胚进行胚胎体重的测量，卵黄膜局部拍照。

1.3 卵黄膜H.E染色

不同实验组的卵黄膜通过4%PFA充分固定后，为了更好的保持组织形态使用四氢呋喃脱水，具体时间是：30%3 h，50%3 h，70%2 h，85%2 h，90%1.5 h，95%I1 h，95%II 1 h，100%I 1 h，100%II 1 h，所有组织常规石蜡包埋，在包埋时把握方向，以获得卵黄囊血管的横切面；H.E染色观察组织形态方面的发育状态。

1.4 RT-PCR

Reverse Transcription-PCR是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。不同实验组的卵黄膜在取材时一部分用4%PFA固定，另外一部分需要加Trizol -80℃冰箱保存备RT-PCR。对吸收转运蛋白调控基因p185进行检测，观察咖啡因暴露对各组的表达差异情况。

1.5 组蛋白H3（PH3）以及凋亡标记物TUNEL的免疫荧光

通过形态学观察，胚胎随着暴露咖啡因剂量的增加，卵黄膜的组织形态受到了影响，转运营养的能力也受到了损伤，为了了解其发生发展的原理，对卵黄膜组织进行了细胞增殖和凋亡的检测。从卵黄囊细胞增殖分化的方向去分析其发育差异的原因：卵黄膜组织经4%PFA充分固定后，3%BSA封闭2 h，加一抗PH3（1：200） ，TUNEL（1：200）4℃冰箱过夜，PBS冲洗10 min×3，加二抗pH3（555） ，TUNEL（488），冰冻切片进行拍照观察。

1.6 统计方法

通过SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料（x±s）和计数资料[n（%）]分别采用t检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎长度的统计分析

单因素方差分析，正常组与中剂量组差异有统计学意义（P<0.05），正常组与高剂量组差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

2.2 卵黄膜形态变化、RT-PCR

不同实验组的卵黄膜通过充分固定后石蜡切片、H.E染色后可以观察到各个实验组在组织形态方面的发育状态存在着明显的差异，同时不同实验组的卵黄膜的p185基因的RT-PCR的结果显示随着浓度的增高有降低的趋势，见图2。

2.3 卵黄膜组织细胞增殖凋亡的变化

通过实验结果显示：胚胎随着暴露咖啡因剂量的增加，卵黄膜的组织的细胞增殖能力减弱，与其相反其凋亡程度增加，从细胞增殖凋亡方面解释了胚胎发育受到影响的原因，见图3。

3 讨论

咖啡因（ caffeine）化学名为 1， 3， 7三甲基黄嘌呤， 又称三甲基黄嘌呤，是一种中枢神经兴奋剂。由于咖啡因可以促进新陈代谢、开胃促消化，并且具有提神和减轻疲劳等功效，使得含咖啡因的饮食产品倍受人们喜爱。与此同时，一些含有咖啡因的非处方药在市面上也非常常见，但是孕期摄入过多咖啡因可引起母体血流动力学的异常改变进而直接影响胎盘和胎儿的发育[6-8]。有研究显示，咖啡因可导致神经胚期鸡胚发育缺陷，高剂量还可影响神经脊细胞的分布于迁移[9]。

该课题研究结果显示，随着暴露咖啡因剂量的增加，该课题发现随着咖啡因剂量的增加，胚胎重量显著降低。低剂量组胚胎重量，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），中剂量的体重与正常组差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组的体重与正常组差异有统计学意义（P<0.01），低剂量组与正常组差异无统计学意义（P>0.05），且存在剂量效应。HE染色结果显示，卵黄膜的血管发育情况变差，同时转运蛋白基因p185的表达随着咖啡因剂量的上升而下降，免疫荧光染色显示，高剂量组与对照组相比细胞增殖下降，细胞凋亡程度增加，细胞周期移植基因p21表达上升。这一系列改变影响了卵黄膜的血液循环，造成了营养物质的交换受到影响，从而影响胚胎的发育，使胚胎的重量随着咖啡因的剂量增加而下降。目前关于这类研究极少，主要在于开展难度较大，国内缺乏相关的技术研究与探索，该次研究也是浅略分析与研究。不过，有研究对咖啡因和妊娠相关不良事件进行了研究，指出咖啡因摄入可能会造成新生儿低体重、流产等不良结局，建议妊娠后避免咖啡因摄入，但也不必完全禁止。

选择鸡胚为实验模型优点，首先是鸡胚是大家熟知的传统的一种生物学模型，其次资源相对丰富、价格实惠、操作简单、实验周期短等等。卵黄囊形成于胚胎孵育的第2天，然后逐渐包围蛋黄，在孵育的第九天时将整个蛋黄包裹起来。卵黄囊延卵黄膜发生，其上密布血管，卵黄囊的作用是呼吸、营养和造血。卵黄囊可为胚胎孵育的前6 d提供氧气；蛋黄内的营养物质被卵黄囊内皮层细胞分泌的消化酶类分解为液状，并由卵黄内壁吸收，然后通过卵黄血液循环将营养运送到胚胎供胚胎发育使用；卵黄囊内壁在孵化初期形成血岛，然后进一步分化成血管内皮层和原始的血球，因此卵黄囊是胚胎发育的呼吸器官、营养器官和造血器官，对胚胎的发育起到至关重要的作用。在胚胎早期发育的过程中，卵黄囊收到任何不良因素影响，都会对胚胎发育造成不良的后果[10-12]。

在我国，含咖啡因的产品消耗量也在逐年增加，且妊娠妇女摄入含咖啡因的饮品、食物和药物的现象也越来越常见。妊娠期妇女长期摄入咖啡因，咖啡因通过胎盘屏障进入胎儿体内，对胎儿神经系统发育会造成什么样的不良影响，具体的表现如何，其发生的分子机制至今尚无定论，国内外的相关报道也较少，所以值得对其进行深入研究，从而对妊娠期妇女安全而且合理的饮食提供科学的依据，实现所倡导的优生优育、提高人口素质的目的，具有重要的伦理价值和现实指导意义。

[参考文献]

[1] Zheng-lai Ma，Yang Qin，Guang Wang，et al.Exploring the caffeine teratogenicity on neurodevelopment using chick early embryo[J].Plos ONE，2012，7（3）：e34278.

[2] 宋文兰.胎儿宫内发育迟缓相关因素的探讨[J].中国优生与遗传杂志，2017（1）：85-86.

[3] Sengpiel V，Elind E，Bacelis J，et al.Maternal caffeine intake during pregnancy is associated with birth weight but not with gestational length： results from a large prospective observational cohort study[J].Bmc Medicine，2013，11（1）：42.

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[7] 楊慕坤，白文佩.咖啡因与妊娠相关不良事件的关系[J].中国全科医学，2017（3）：365-369.

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[9] 覃杨.咖啡因对鸡胚神经发育的影响[D].广州：暨南大学，2011.

[10] 张娴，邹豪，高申.咖啡因的大鼠在体肠吸收动力学研究[J].第二军医大学学报，2007，28（3）：318-321.

[11] 宜立航，袁玉如.氨茶碱和咖啡因对呼吸功能作用的比较研究[J].华西医学，1995，10（2）：126-127.

[12] 刘洪杰，朱艳萍.枸橼酸咖啡因在新生儿期的临床应用进展[J].中国医药导报，2015（33）：69-73

（收稿日期：2018-06-12）