螺旋藻激酶对急性血瘀模型大鼠的影响*

黄媛恒，覃斐章，李映新，原春兰，蒋丽梅，王 琳，庞 辉△

(广西医科大学：1.基础医学院；2.药学院；3.第一临床医学院，南宁 530021)

论著·基础研究

螺旋藻激酶对急性血瘀模型大鼠的影响*

黄媛恒1，覃斐章2，李映新2，原春兰3，蒋丽梅3，王 琳3，庞 辉1△

(广西医科大学：1.基础医学院；2.药学院；3.第一临床医学院，南宁 530021)

目的探讨螺旋藻激酶(SPK)对急性血瘀模型大鼠的血液流变学、血小板聚集率和环磷酸腺苷(cAMP)的影响。方法40只SD大鼠分为正常对照组、模型组、阿司匹林组和SPK高、低剂量组，灌胃给药7 d，采用肾上腺素冰水浴刺激复制急性血瘀大鼠模型，应用全自动血流变测定仪检测全血黏度、血浆黏度、红细胞压积(Hct)、红细胞聚集指数(EAI)、红细胞变形指数(DI)和红细胞刚性指数(ERI)，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆cAMP的水平，采用二磷酸腺苷诱导大鼠血小板聚集，用比浊法测定最大聚集率。结果SPK可以降低急性血瘀大鼠的全血黏度，血浆黏度、Hct、EAI和血小板最大聚集率，升高血浆cAMP水平，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，对DI和ERI无明显影响。结论SPK能明显改善急性血瘀大鼠血液流变学的异常变化且具有抗血小板聚集作用。

螺旋藻激酶；血瘀；血液流变学；血小板聚集；环磷酸腺苷

螺旋藻是天然海洋生物，广泛分布于中国广西、浙江、海南等省区，具有抗氧化、降血脂、抗衰老、抗损伤、提高免疫力等药理作用[1]。笔者前期研究发现，螺旋藻经过发酵酶化干燥后，从中提取出一种具有蛋白激酶类活性成分，称为螺旋藻激酶(spirulina kinase，SPK)，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定为电泳纯，其相对分子质量为 40×103，属于丝氨酸蛋白酶，结构中不含二硫键[2-3]。前期药理作用研究表明其具有一定抗血栓、抗凝血及保护血管内皮细胞作用[4-6]。本实验拟通过肾上腺素与冰水刺激复制急性血瘀大鼠模型，观察SPK对血瘀证模型动物血液流变学、血小板聚集率的影响，并对血浆环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的水平进行了测定，为进一步开发SPK提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 清洁(SPF)级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证SCXK桂2009-0002，实验动物使用许可证SCXK桂2009-0004。主要试剂： SPK由本实验室自行提取；阿司匹林肠溶片100 mg/片购自拜耳医药保健有限公司，批号BJ27607；盐酸肾上腺素注射液购自上海禾丰制药有限公司，批号201512；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)购自Sigma公司，批号A2754；cAMP试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，批号L151201132。主要仪器：SA9000全自动血流变测试仪购自北京赛科希德科技发展有限公司；iMark酶标仪购自美国Bio-Rad公司；血小板功能检测仪700购自美国Chrono-Log公司；TGL-16A冷冻离心机购自长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组和给药 40只SD大鼠分为5组，即正常对照组、模型组、阿司匹林组(0.1 g/kg)和SPK高、低剂量组(1.0、0.5 g/kg)，正常组和模型组给予等体积的生理盐水，灌胃给药，每天1次，连续7 d。

1.2.2模型制备[7]第6天给药后30 min，除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠均皮下注射盐酸肾上腺素0.8 mg/kg，2 h后将大鼠浸入0～5 ℃冰水中5 min，2 h后再按0.8 mg/kg皮下注射盐酸肾上腺素以复制急性血淤模型，正常对照组大鼠仅皮下注射等容积生理盐水且不给予冰水刺激；所有禁食不禁水12 h。

1.3检测指标 第7 天末次给药30 min，各组大鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝全血用全自动血流变速测定仪检测血液流变学指标：包括全血黏度(1/s、50/s、200/s)、血浆黏度、红细胞压积(Hct)、红细胞变形指数(DI)、红细胞聚集指数(EAI)及红细胞刚性指数(ERI)；另取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，4 ℃，3 500 r/min，离心15 min，分离血浆，用ELISA法检测cAMP水平，按试剂盒说明书操作；以3.8%枸橼酸钠抗凝，全血以1 000 r/min离心10 min， 取其上清液即为富血小板血浆，余下部分以3 000 r/min离心10 min，取其上清液即为贫血小板血浆，按Born比浊法测定二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板最大聚集率。

2 结 果

2.1SPK对血瘀证模型大鼠血液流变学的影响 与正常对照组比较，模型组全血低、中、高切黏度、血浆黏度、Hct、EAI均明显增高，DI和ERI下降；高剂量SPK(1.0 g/kg)能明显降低全血低、中、高切黏度，并能降低血浆黏度、EAI、Hct，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而对DI和ERI无明显影响，见表1、2。

2.2SPK对血瘀证模型大鼠ADP诱导血小板聚集率的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血小板聚集率明显升高。与模型组比较，SPK高剂量组(1.0 g/kg)对ADP诱导的血小板聚集率有明显抑制作用(P<0.05)，见表3。

表1 SPK对急性血瘀大鼠全血黏度的影响

a：P<0.05，与模型组比较

表2 SPK对急性血瘀大鼠血浆黏度、Hct、EAI、DI、ERI的影响

a：P<0.05，与模型组比较

2.3SPK对血瘀证模型大鼠血浆cAMP水平的影响 模型组大鼠血浆cAMP水平为(140.74±15.55) pg/L，与正常对照组相比，明显下降。与模型组比较，SPK高剂量组(1.0 g/kg)能明显提高大鼠血浆cAMP水平，见表3。

表3 SPK对ADP诱导的急性血瘀大鼠血小板聚集率、 血浆cAMP水平的影响

a：P<0.05,b：P<0.01，与模型组比较。

3 讨 论

现代药理学研究表明，血栓形成的重要原因有血管内皮细胞的损伤、血小板聚集及相关活化因子的释放，纤溶活性的降低，血液黏度的增大，血流状态的改变等。目前临床上血液的浓、黏、凝、聚是造成血栓的主要原因。可见，血液流变学的改变在血栓形成过程也起了关键作用，它主要反映由于血液成分变化而带来的血液流动性、凝滞性和血液黏度的变化。血液流变学的异常在许多疾病的发生发展发挥重要的作用，研究表明患高血压、高血脂、急性心肌梗死、冠状动脉疾病、脑卒中等人群均出现血液流变学异常[8-11]。

血瘀就是一组血液循环障碍或血液流变学行为异常的疾病。皮下注射肾上腺素加冰水浸泡复制的大鼠急性血瘀模型，表现出血液高凝、全血黏度增加等血液流变学的异常变化[12]。血液流变学的改变通常应用全血黏度、血浆黏度、Hct、纤维蛋白原定量、DI和EAI等指标来反映。血液里的细胞成分(血小板、红细胞)和血浆里的成分(糖、脂、纤维蛋白原)的变化会导致血液流变性的改变。全血黏度是反映血液流变性最重要的指标，受血浆黏度、血小板聚集性、Hct、红细胞聚集性和变形性等影响，而血浆黏度由血浆蛋白浓度、形式决定。本研究结果显示急性血瘀大鼠血液流变学发生异常改变，由ADP诱导剂诱导的血小板聚集率明显升高，SPK可以降低急性血瘀大鼠的全血高、中、低切黏度，降低血浆黏度、Hct和EAI，以及抑制血小板的聚集。同时，本实验观察了血瘀大鼠血浆cAMP的水平。cAMP作为血小板的第二信使对血小板功能的调节起重要作用，cAMP主要通过降低细胞内 Ca2+水平、抑制血小板肌球蛋白磷酸化、促进前列腺素E2(PGE2)和前列腺A2(PGI2)的合成、抑制血栓素(TXA2)合成及抑制凝血酶与其受体结合等抑制血小板的活化[13]，从而影响血小板聚集功能，在血液高凝态和微循环障碍的发展过程中有重要的意义。因此当cAMP水平降低，则可促进血小板聚集，易致血液高凝态，结果显示急性血瘀大鼠cAMP水平明显下降，SPK可升高cAMP水平，推断其抑制血小板聚集可能与之有关，具体机制有待进一步研究。

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TheeffectsofSpirulinakinaseinratswithacutebloodstasis*

HuangYuanheng1,QinFeizhang2,LiYingxin2,YuanChunlan3,JiangLimei3,WangLin3,PangHui1△

(1.CollegeofBasicMedicine;2.Collegeofpharmacy;3.CollegeofFirstClinicalMedical,GuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveIn this study,the effect of Spirulina kinase(SPK)on hemorheology,platelet aggregation and cAMP in acute blood stasis rats model were investigated.MethodsForty SD rats were randomly divided into normal control group,model group,aspirin group and the high and low dose of SPK groups.All treatments were performed by gavage once a day for 7 days.Subcutaneous injection of adrenalin combined with ice water bath were used to establish the acute blood stasis rat model.The whole blood viscosity,plasma viscosity,red blood cell hematocrit (Hct),erythrocyte aggregation index (EAI),red blood cell deformation index(DI)and erythrocyte rigidity index(ERI) were detected by automatic blood flow speed analyzer.Meanwhile,the level of cAMP was detected by ELISA method.Rat platelet aggregation induced by ADP and the maximum aggregation rate was measured by turbidimetry.ResultsResults showed that SPK could significantly decrease the whole blood viscosity,plasma viscosity,Hct,EAI and platelet aggregation rate,increase the level of cAMP compared with model group(P<0.05),but had no effect on DI and ERI.ConclusionSPK can markedly improve the abnormal changes of hemorheology in acute blood stasis rats and inhibit the platelet aggregation.

] Spirulina kinase;blood stasis；hemorheology;platelet aggregation;cAMP

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.003

广西自然科学基金资助项目(2014GXNSFBA118156，2014GXNSFBA118188，2013GXNSFAA019176)；2013年广西壮族自治区区级大学生创新创业训练计划项目(桂教高教[2013]14号)。

黄媛恒(1982-)，讲师，硕士，主要从事生化药理学研究。△

，E-mail:454720524@qq.com。

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1671-8348(2017)36-5047-02

2017-07-06

2017-08-08)