RT-PCR荧光探针技术检测中药辅助治疗犬瘟热临床疗效的研究

张永霞 王金福 宗 琪 陈菊红

（上海农林职业技术学院，上海 201600）

RT-PCR荧光探针技术检测中药辅助治疗犬瘟热临床疗效的研究

张永霞 王金福 宗 琪 陈菊红

（上海农林职业技术学院，上海 201600）

基于前期中药辅助治疗犬瘟热病研究的基础，本次研究将186只来自上海三家宠物医院2014～2016年就诊的犬瘟热病犬随机分为两组，第一组为96只，仅用西药治疗。第二组为90只，在西药治疗的基础之上运用中药进行辅助治疗。然后随机选取了62只（每组31只），用RT-PCR荧光探针技术检测治疗14d后病犬的外周血血清中的犬瘟热病毒抗原。研究结果表明：添加中药辅助治疗组阳性率比仅用西药组下降38.71%，说明应用课题组研发的中药可有效地消灭病犬体内的犬瘟热病毒。

RT-PCR荧光探针 中药辅助治疗 犬瘟热 临床效果

犬瘟热是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一种高度接触性、传染性、致死性疾病。病犬早期表现为双相热型、急性卡他性鼻炎、后期以支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为主要特征，少数病例可出现脚垫和鼻端的高度角化。犬瘟热病犬的病死率可达80%[1]。前期，课题组已研发出治疗犬瘟热的中药胶囊，并进行了为期一年的宠物医院临床用药情况记录与统计，研究表明，课题组研发的中药制剂对辅助治疗犬瘟热病有较好的效果。本研究应用RT-PCR荧光探针技术对比检测仅用西药治疗和加入中药辅助治疗的病犬的外周血血清中犬瘟热病毒含量，初步研究出中药辅助治疗对犬瘟热病有效的机理，为课题组研制的治疗犬瘟热的中药制剂在临床大规模应用提供一定的理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品：犬六联高免血清购自中国人民解放军军需大学兽医学院生物制品研究中心；中药胶囊中所用的中药饮片黄芩、黄连、生石膏、知母、杏仁等均购买于自上海余天成大药房；犬干扰素-α购自中科拜耳生物技术有限公司；犬瘟热单克隆抗体和免疫球蛋白均由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产；犬瘟诊断试纸为韩国瑞必诊快速诊断试纸。

1.1.2 试剂：RNA提取试剂盒、犬瘟热病毒（CDV）核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）购自上海江莱生物科技有限公司。

1.1.3 仪器：冷冻离心机（Eppendorf）、ABI Step-One-Plus荧光定量PCR仪。

1.1.4 试验动物：来自三家上海的宠物医院2014～2016年前来就诊的186只犬瘟热患病犬。

1.2 方法

1.2.1 犬瘟热病确诊依据：犬瘟热诊断试纸检测为阳性，结合出现发热、饮欲增加、食欲不振、流水样鼻液等临床症状。

1.2.2 病犬分组：第一组96只，采用西药常规治疗即病初注射免疫球蛋白、IFN、高免血清、犬瘟热单克隆抗体，出现呕吐症状添加654-2，有炎症发生添加头孢菌素等抗生素治疗。第二组90只，在第一组治疗的基础之上，用前期研发的中药胶囊进行中药辅助治疗。

1.2.3 待测血清的制备：从上述1.2.2病犬之中随机选择62只（每组31只），取每只病犬治疗14d后的外周静脉血2ml，1000×g离心20min，吸取上清液即可。

1.2.4 RNA的提取：依据上海江莱生物的RNA提取试剂盒说明书进行检测：取待检血清100μl，添加100μl Solution R1，振荡混合30s，室温静置1min；混匀样本，加入600μl Solution R2颠倒混匀，室温下静置3～5min；把上清液转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去套管中液体。加入600μl Wash Buffer，12000rpm离心30s，重复此步一次。空柱10000rpm离心1min，把空心柱转移至新的1.5ml灭菌离心管中。加入10～20μl Elution Buffer 到吸附膜的中央，室温下静置1min，离心30s，即获得总RNA。

1.2.5 RT-PCR荧光探针检测样品CDV核酸：每个反应管中加入CDV反应液20μl，酶液1μl，将每个样品提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μl，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内。设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μl；荧光通道选择：检测通道FAM。淬灭通道NONE。循环参数设置（见表1）。

表1 荧光PCR循环参数t

2 结果

2.1 阴性和阳性质控品检测结果

阳性、阴性各只取一组数据进行画图，见图1。从图中可见阳性呈明显指数增长曲线，且Ct值约为7，小于32，而阴性无指数增长曲线，判定此次试验成功。

图1 阴性和阳性质控品扩增曲线

2.2 两组CDV RNA RT-PCR荧光探针检测结果

检测结果判断的标准如下：阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；可疑：检测通道35.0＜Ct值≤37，需重复检测，如检测通道仍为35.0＜Ct值≤37，且曲线有明显的指数增长曲线，判断为阳性，否则为阴性；阴性：样本检测结果Ct值＞37或无Ct值。本研究对两组共62份（每组中各选取31只）临床治疗14d的CDV临床病犬的血清进行RT-PCR荧光探针检测结果显示：第一组（常规西药治疗组），31只犬中有22只为阳性，阳性率为70.97%；第二组（中药辅助治疗组），31只犬中有10只为阳性；阳性率32.26%。中药辅助治疗组阳性率比常规西药组下降38.71%。其中部分阳性样品扩增曲线见图2，部分阴性样品扩增曲线见图3。

图2 部分阳性样品扩增曲线

图3 部分阴性样品扩增曲线

3 讨论

（1）荧光 PCR是在 PCR 的基础上发展起来的一种新的核酸检测技术[2]。荧光PCR技术 具有无须做梯度稀释便可准确的定量检测，定量范围极宽，无须PCR后处理，特异性强，克服了单纯PCR 高效扩增产生的假阳性结果，有较高的准确性和比普通 PCR迅速、灵敏、简便等优点。因此，荧光PCR 可为临床病情观察和治疗提供可靠的依据[3-4]。本研究所用的犬瘟热病毒（CDV）核酸RT-PCR荧光探针试剂盒，阳性和阴性参考品的符合率均为100%，最低检测限为5.0×102copies/ml，批内，批间精密检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%，符合试验要求。

（2）目前，在犬瘟热中药治疗方面，只有方爱国等少数人进行了尝试[5-6]。前期，课题组已研发出治疗犬瘟热的中药胶囊，且进行了为期一年的临床效果研究，研究发现，课题组研发的中药胶囊对犬瘟热病犬有较好的辅助治疗效果。本研究通过RT-PCR荧光探针技术对比检测仅用西药治疗和应用中药辅助治疗的患病犬的外周血血清中犬瘟热病毒含量，研究结果表明中药辅助治疗14d后，中药辅助治疗组阳性率比常规西药组下降38.71%，这说明中药辅助治疗可有效地杀灭患犬体内的犬瘟CDV，为前期课题组所研发的治疗犬瘟热的中药胶囊的临床应用提供了一定理论依据，也为犬瘟热的中药临床治疗研究提供一定的参考。

（3）犬瘟热病属于瘟热之邪，课题组所研发的中药胶囊中含黄芩、大黄、鱼腥草、炙麻黄、杏仁、生石膏、知母、浙贝母、桔梗、柴胡、葶苈等中药，中医理论认为黄芩、大黄、鱼腥草、生石膏都性寒，有清热解毒的作用，主治温热病，中医研究表明黄芩、大黄、鱼腥草等都具有抗病毒作用[7-9]，本研究表明黄芩、大黄、鱼腥草等具有抗CDV的作用。

（4）本研究采用先将确诊犬瘟热的186只病犬，分成两组治疗；第一组96只，用常规西药治疗；第二组90只，在第一组治疗的基础之上，用前期研发的中药胶囊进行辅助治疗。后从中随机选取62只（每组各取31只）进行RT-PCR荧光探针技术检测治疗效果研究，符合统计学上的随机原则。

[1] 韩博.犬猫疾病学[M].北京：中国农业大学出版社，2011：20-24.

[2] Wall S J，Edward D R.Quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction（TR-PCR）：A comparison of prime-dropping，competitive，and real-time RT-PCR[J].Anal Biochem，2002，300（2）：269-273.

[3] 欧阳松应，杨冬，欧阳红生，等.实时荧光定量 PCR 技术及其应用[J].生命的化学，2004，24（1）：74-76.

[4] 张贺，李波，周虚，等.实时荧光定量 PCR 技术研究进展及应用[J].动物医学进展，2006，（27）：5-12.

[5] 王传春，沈美艳.中药治疗犬瘟热的体会[J].山东畜牧兽医，2017，38（6）：97.

[6] 方爱国，王和平.中药清开灵注射液对犬瘟热的疗效观察[J].养犬，2008，（1）：21.

[7] 熊海蓉，杨占秋.大黄抗炎抗病毒作用的研究[J].医学新知，2014，（3）：159-160.

[8] 王羽侬，金叶智.黄芩及其成分抗流感病毒感染的实验研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（27）：5365-5369.

[9] 王健，史玉.鱼腥草不同部位提取物的抗菌抗病毒作用比较[J].河北工程大学学报（自然科学版），2010，27（2）：104-106.

宜的养殖用地也难以承担1.2万元/667m2的土地复耕保证金。

4.3 政府未设置畜禽粪污治理专项资金

畜禽养殖污染重在防，防污与未染，这就要求建设沉淀池、沼气池、管网等设施设备，需要不菲的资金。2014年1月1日颁布的《畜禽规模养殖场污染防治条例》规定，各级人民政府应采取措施，加大资金投入，扶持畜禽养殖污染防治以及畜禽养殖废弃物综合利用；县级以上人民政府应当采取示范奖励等措施，扶持规模化、标准化畜禽养殖，支持畜禽养殖场（小区）进行标准化改造和污染防治设施建设与改造，但目前财政资金投入严重不足，也未设置畜禽粪污治理专项资金。如果遵循“谁投资谁受益”的市场法则，由利润不高的养殖户来支付恐无力承担。

5 推进生态养殖业发展的意见建议

5.1 加大宣传，共筑生态健康养殖氛围

通过会议、网络、印发明白纸等多种形式向广大养殖场户宣传生态健康养殖重要意义，使生态健康养殖成为养殖场的自觉行动。并利用科技入户项目将生态健康养殖新技术、新模式、新经验，面对面地宣讲到场户，为畜牧生态健康养殖奠定坚实的基础。同时也让政府部门看到生态养殖的成效，接收生态养殖无污染。

5.2 加强政策扶持、强化组织领导

一是统筹安排现有项目，如畜禽标准化示范场创建、特色效益农业切块资金项目等方面的资金，加大对生态养殖业发展的支持力度。二是创新拓宽融资渠道，采取贷款担保、政策保险、贷款贴息等方式，建立生态养殖业发展投融资和担保体系。三是强化科技支撑，培育品牌，加强典型示范，积极引导社会资本发展生态养殖业。四是强化组织领导，加强公共服务，构建政府主导、多方参与、灵活高效的投入新机制，推进生态养殖业健康发展。五是以奖代补引导治污，政府可以采取“以奖代补”等多种形式，扶持养殖场（户）更新设备。

上海农林职业技术学院科研资助项目（KY1-0000-14-07）

张永霞（1977-），女，硕士，副教授，主要从事分子病理检测和中药治疗方面的教学与研究工作。