猪场粪肠球菌耐药性流行病学调查与分析

卓鸿璘

（泉州市洛江区虹山乡畜牧兽医站，福建泉州 362011）

猪场粪肠球菌耐药性流行病学调查与分析

卓鸿璘

（泉州市洛江区虹山乡畜牧兽医站，福建泉州 362011）

为了解生猪规模化养殖场粪肠球菌的耐药情况，探讨不同抗菌药使用对细菌产生耐药性的影响，本研究采用了美国临床检验标准委员会（CLSI）推荐的肉汤微量稀释法及判定标准，调查了365株分离自建场时间短、用药规范的猪场Ⅰ、猪场Ⅱ和建场时间长、用药混乱的猪场Ⅲ粪肠球菌对六种抗菌药的耐药率。结果显示：分离菌对土霉素、红霉素、氯霉素和环丙沙星存在不同程度的耐药，耐药率分别为：99.5%、98.1%、70.7%、47.8%，对万古霉素、氨苄西林较敏感；三个用药情况不同猪场分离菌对六种抗菌药物的耐药率相差不大；哺乳小猪和保育小猪统称为小猪的分离菌对六种抗菌药物的耐药率比哺乳母猪、怀孕母猪、大猪、和公猪统称大猪分离菌的耐药率高；分离菌对六种抗菌药物存在多重耐药；三个猪场分离菌对六种抗菌药有相似的多重耐药情况。试验结果初步揭示了生猪养殖场粪肠球菌的耐药情况，提示用药方式、用药频率等与耐药率、耐药水平和多重耐药等存在一定的联系。

粪肠球菌 耐药性 养猪场 多重耐药 调查

肠球菌是一种革兰氏阳性菌，可以从多种自然环境中分离，是人和动物肠道的正常菌群。作为条件致病菌，肠球菌是医院感染特别是尿路感染的重要病原菌之一，也是污染肉类和乳类等动物性食品的常见细菌种类之一，近年来动物感染肠球菌发病与死亡病例的报道也越来越多。由于其细胞壁坚厚，肠球菌对许多抗生素表现为固有耐药，且易被诱导产生新的耐药性，临床上一旦肠球菌对万古霉素产生耐药，就很难找到合适的治疗药物，只能依赖最新研发的抗菌药。

大量的抗菌药物用于动物疾病的预防与治疗以及作为抗菌促生长剂对细菌的耐药性产生巨大的选择压力，养殖场已经成为耐药菌产生的主要地方之一。现在科学工作者已经证实人与人之间，动物与动物之间，人与动物之间均存在耐药基因的传递问题。养殖场的耐药菌将对人类健康产生深远的影响。调查肠球菌的耐药性不仅能为养殖场用药提供参考，还具有重要的公共卫生意义。

本试验以粪肠球菌为指示菌，调查了福建省三个规模化猪场的分离粪肠球菌对六种抗菌药的耐药率，探讨不同抗菌药物使用情况对细菌耐药性产生的影响，为了解和掌握动物源性细菌耐药性产生和指导兽医临床合理使用抗菌药物以及深入开展细菌耐药机制的研究提供参考。

1 主要材料

1.1 菌株来源

样本菌株分离至福建省3个规模化养猪场肛门采集棉拭子，样本采集的对象包括哺乳母猪、哺乳小猪、保育小猪、大猪、公猪、怀孕母猪和环境。其中猪场Ⅰ、猪场Ⅱ建场时间比较短，属于新场，猪场Ⅲ建场时间比较长属于老场。标准菌株：粪肠球菌（ATCC29212），购自中国药品生物制品检验所。

1.2 药品与试剂

胰蛋白大豆营养琼脂和肠球菌培养基购自英国OXOID公司；MH-肉汤购自北京双旋微生物培养基制品厂；土霉素、氯霉素、万古霉素、氨苄西林、环丙沙星和红霉素标准品，均购自中国药品生物制品检验所；PCR反应体系购自北京天根生化有限公司；PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.3 主要仪器与设备

智能恒温恒湿培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂，型号HWS-250）；紫外可见分光光度计（日本岛津公司，型号UVmini-1240）；PCR仪（德国Eppendorf公司，型号 Eppendorf Mastercycler ABI 2720）；电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6C）；凝胶成像系统（英国UVI Tec公司，型号UVI Tec DBT 2.08）。

2 具体方法

2.1 样本采集

用灭菌棉签在猪的肛门采样后，放进装有1ml灭菌肉汤的试管，当天带回实验室培养。

2.2 细菌分离、纯化

采集的样本在培养箱增菌8h后，在肠球菌培养基上划线分离，37℃培养48h后，选取典型单菌落在胰蛋白大豆营养琼脂平板上增菌、纯化。

2.3 细菌鉴定

采用P C R方法，可通过使用引物（E f 0 0 2 7 F：5_-G C C A C T A T T T C T C G G A C A G C-3_；E f 0 0 2 7 R：5_-GTCGTCCCTTTGGCAAATAA-3_），扩增出一段518bp特异性片段，对细菌进行鉴定。首先，依次在eppendorf管中加入5μl 10×Taq Buffer（Mg2+plus）、4μldNTP Mixture（各2.5mM）、2.5μl上游引物、2.5μl下游引物、0.5μlTaqDNA聚合酶、30.5μl灭菌超纯水和5μl5×108CFU/ml菌悬液，配成50μlPCR反应体系，然后轻微混匀后放入PCR仪，经过95℃变性5min，然后94℃30s、60℃30s、72℃1min 35次循环，再经过72℃延伸5min，完成特异性基因片段扩增，最后，将PCR产物与点样缓冲液混匀后在添加有溴化乙啶的1.5%琼脂糖上电泳20min后，在凝胶成像系统观察结果。

2.4 细菌保存

将菌株接种在肉汤隔夜培养后，加入灭菌甘油，制成的20%甘油菌，置于-20℃冰箱保存。

2.5 细菌药敏试验

本试验根据美国临床检验标准委员会（CLSI）推荐的肉汤微量稀释法的规范进行操作。首先，在96孔聚苯乙烯细胞培养板的1～11孔中依次加入0.1ml浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg /ml的抗菌药物，然后在每个相应的孔中加入0.005ml浓度为107CFU/ml的菌液，并在每个板设立阴性和阳性对照孔，最后将平板放在37℃恒温恒湿培养箱培养16～20h后观察结果。

2.6 细菌药敏试验结果判定

根据美国临床检验标准委员会（CLSI）提供的判定标准（表1）来判断细菌对抗菌药物的耐药程度。

表1 肠球菌稀释法药敏试验解释标准

2.7 统计学处理

应用Excel软件对药敏试验数据进行统计与分析。

3 结果与分析

3.1 样本收集及菌株分离结果

调查了3个规模化养猪场，猪场Ⅰ随机采了60份样本，并从中分离了46株粪肠球菌，猪场Ⅱ、猪场Ⅲ分别对不同阶段的猪及环境进行采样，详情见表2。

表2 猪场Ⅱ、Ⅲ采样和分离菌情况

3.2 生猪规模化养殖场抗菌药物使用情况

目前生猪规模化养殖场大量使用各类抗菌药物，用于疾病的预防和治疗以及促进动物生长等，这些药物以饲料添加剂，药物预混剂和针剂等形式进入养殖场，对养殖场细菌产生广泛的影响。本研究选择3个试验猪场，其中猪场Ⅰ和猪场Ⅱ建场3～4年，猪群健康状况一直较好，临床上一般只进行常规预防用药，同时没有违规使用一些禁用药物；猪场Ⅲ建场12年，猪群健康状况较差，临床用药混乱，经常长期使用各类抗菌药进行治疗和预防。目前3个生猪养殖场使用的抗菌药范围很广，但都还没有使用万古霉素。

3.3 粪肠球菌分离菌株对6种抗菌药物体外敏感性

3个猪场共采集了389份样本，以每个样本不超过一株分离菌为原则，随机分离了365株粪肠球菌。分离菌对六种抗菌药物的药敏试验结果见表7。分离菌对万古霉素、氨苄西林最敏感，敏感率分别为96.4%和93.2%。分离菌对土霉素、红霉素、氯霉素、环丙沙星存在不同程度的耐药，耐药率分别为99.5%、98.1%、70.7%、47.8%。本试验分离菌对万古霉素的耐药率3.3%与顾欣等报道上海地区规模猪场分离菌的耐药率相当接近，据国外报道猪场分离的粪肠球菌对万古霉素的耐药率与某些抗菌促生长剂在动物饲料的添加有关系。四环素类和大环内酯类药物在猪场上经常用于疾病的预防与治疗，部分药物还具有促生长作用，经常作为饲料常规添加药物。猪场分离菌对本研究所选择的抗菌药物土霉素和红霉素已经接近完全耐药了，临床上应该尽量少用或不用。氯霉素在饲料添加已经禁止使用几年了，但是猪场分离菌对氯霉素仍然有较高的耐药率，这也许与氯霉素使用时间长和氯霉素类的氟苯尼考在猪场饲料中添加有关。喹诺酮类药物抗菌效果好，与其他抗菌药无交叉耐药性，随着喹诺酮类药物在猪场的广泛应用，猪场分离菌对本研究选择的抗菌药物环丙沙星已经有47.8%的耐药率，临床上应该慎用。

3.4 不同采样分类粪肠球菌对六种抗菌药物耐药率比较

3.4.1 三个不同猪场分离粪肠球菌对六种抗菌药耐药率比较

三个不同猪场分离粪肠球菌对六种抗菌药耐药率比较（见图1）。三个不同猪场分离粪肠球菌对六种抗菌药的耐药率相差不大，对万古霉素和氨苄西林敏感，对土霉素和红霉素耐药率较高，其次是氯霉素和环丙沙星。三个猪场分离菌对土霉素的耐药率十分接近；对环丙沙星、红霉素的耐药率以猪场Ⅲ最高，猪场Ⅱ次之，猪场Ⅰ最低；对万古霉素、氯霉素的耐药率以猪场Ⅱ最高，猪场Ⅰ和猪场Ⅲ相当接近。不同的猪场虽然有用药时间和程度的差异，但猪场的用药模式相似，因此分离菌对六种抗菌药的耐药率比较接近。不同猪场分离菌对环丙沙星、红霉素、万古霉素、氯霉素耐药率的差异，可能跟猪场使用抗菌药物品种的差异和短期用药的差异有关。

图1 不同猪场分离粪肠球菌耐药率比较

3.4.2 小猪、大猪分离粪肠球菌耐药率比较

本研究将哺乳小猪和保育小猪统称为小猪，哺乳母猪、大猪、公猪、怀孕母猪统称为大猪，并对124株小猪分离菌和124株大猪分离菌对抗菌药的耐药率进行比较（见图3）。小猪和大猪分离粪肠球菌对六种抗菌药物的耐药率存在差异。小猪分离菌对六种抗菌药的耐药率都比大猪分离菌高。小猪和大猪分离粪肠球菌对土霉素和红霉素的耐药率比较接近，四环素类和大环内酯类药物在猪场上有很长的用药历史，粪肠球菌在长时间的选择压力下导致小猪和大猪分离菌都存在高的耐药率。对万古霉素、氨苄西林、环丙沙星和氯霉素的耐药率差异较大。小猪比较容易感染致病，药物在小猪阶段的使用频度更高，使用时间更长，因此小猪肠道菌群有更高的耐药率。

图2 小猪、大猪分离粪肠球菌耐药率比较

3.5 猪场分离粪肠球菌对6种抗菌药物耐药谱

分别以T、L、W、A、H、R代表土霉素、氯霉素、万古霉素、氨苄西林、环丙沙星和红霉素来表示分离菌对6种抗菌药的多重耐药，如：TAHR表示对土霉素、氨苄西林、环丙沙星和红霉素多重耐药。猪场分离粪肠球菌对6种抗菌药物有17型耐药谱（见表4），TLHR、TLR、TR、THR、TLAHR、TLWR型的耐药谱占的比率分别为32.1%、29%、14.8%、11.2%、2.5%1.4%；其他的耐药谱型T、TLWHR、LR、TL、TWR、TLH、TAHR、TLAH、TLAR、TLAWR、TLWHAR各自占的比率都低于1%。TLHR、TLR耐药谱型占17型耐药谱的比率高达61.1%，与土霉素、氯霉素、红霉素和环丙沙星及其同类抗菌药物在猪场使用的时间和频率有着必然的联系。

表3 猪场的分离粪肠球菌体外药敏试验结果

表4 猪场分离粪肠球菌耐药谱情况

3.6 三个不同猪场分离粪肠球菌多重耐药比较

三个猪场分离菌对六种抗菌药物有相似的多重耐药情况。3个猪场分离菌的多重耐药都以2、3、4重耐药居多。猪场Ⅰ和猪场Ⅲ有出现5重耐药分离菌，以3重耐药43.5%、42.8%的比率最高。猪场Ⅱ最高有出现6重耐药菌，以4重耐药（43.8%）的比率最高，紧跟着是4重耐药（39.9%）。猪场分离菌的多重耐药情况初步显示了，猪场的用药习惯往往根据经验，局限于使用相对固定的几种药物，未能根据细菌的药敏性及时做出调整。

图3 三个猪场分离粪肠球菌多重耐药比较

4 讨论

4.1 国内养殖场万古霉素耐药性的粪肠球菌应引起关注

国内已有多份报道表明猪源分离粪肠球菌对万古霉素存在一定程度的耐药率。钱晓璐等对上海地区猪源分离粪肠球菌的耐药性分析表明40株粪肠球菌，有4株对万古霉素耐药，其中2株表现对万古霉素高度耐药。顾欣等对2013年3月-2014年5月从上海地区10个规模化养猪场分离的133株粪肠球菌进行药敏试验，表明分离菌对万古霉素的耐药率为3.01%。王送林等对湖南省猪源粪肠球菌的耐药性分析表明42株分离粪肠球菌对万古霉素的耐药率高达31%。耐万古霉素的粪肠球菌对人类生命的威胁在逐年的增加中，养殖场耐万古霉素的粪肠球菌的产生和传播在国外得到高度的重视。根据本试验的结果，国内养殖场万古霉素耐药的粪肠球菌也不容忽视。

4.2 建议加强宣传与指导养殖场合理使用抗菌药物

本试验细菌耐药谱和多重耐药分析都表明养殖场的常用药习惯性地局限于固定的几种，没有根据药敏试验及时选择针对性比较强的药物。目前养殖场抗菌药物使用比较混乱，养殖场兽医水平参差不齐，建议动物疫病防控中心要加强养殖场合理使用抗菌药物的宣传与指导，加强本地区细菌耐药性调查与分析，指导基层兽医站人员和养殖场兽医合理使用抗菌药物，将提高一线从业兽医合理使用抗菌药物的水平纳入重点工作中。

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