组织工程技术治疗骨软骨缺损的研究进展

胡宏悻，步子恒，刘忠堂

（1温州医科大学附属第二医院骨科，浙江温州325027；2第二军医大学附属长海医院关节骨病外科，上海200433）

组织工程技术治疗骨软骨缺损的研究进展

胡宏悻1，步子恒2，刘忠堂2

（1温州医科大学附属第二医院骨科，浙江温州325027；2第二军医大学附属长海医院关节骨病外科，上海200433）

0 引言

关节软骨被覆关节表面，起到润滑、减震、缓解压力等作用．软骨组织缺乏血运，本身不含祖细胞，自愈能力十分有限，一旦关节软骨出现缺损，如不治疗，缺损可继续增大，造成软骨合成代谢和分解代谢的紊乱，引起骨性关节炎（osteoarthritis， OA）［1］．炎症的存在以及血运的缺乏使得关节软骨缺损治疗变得愈加困难．研究［2］表明，症状性膝关节骨关节炎影响24%的总人口，在50岁以上的人群中非常普遍，全世界超过2亿5千万人．到2020年OA有望成为第四大致残原因．目前，对于这种关节软骨损伤和缺损的治疗是临床医生面临的一个重要难题，也是骨科基础研究的热点．常用的手术和非手术治疗方法的目的在于减轻疼痛和保存软骨功能，非手术方法如控制体质量、适当限制活动量以减少关节磨损．口服药物和关节内注射药物治疗虽然可以暂时缓解疼痛，但仍是治标不治本，且两种方法都有其明显的局限性．目前手术治疗广义上分为微骨折术、关节骨软骨移植术、软骨膜移植术及关节软骨再生术等．其中微骨折术的目的是刺激骨髓间充质干细胞（bone manrrow mesen-chymal stem cells，BMSCs）迁移至软骨下骨产生主要由Ⅰ型胶原组成的纤维软骨以填充于骨软骨缺损的表面．但是，纤维软骨缺少透明软骨所具有的组织学和生物力学特性，因此当受到压力和剪切力时其稳定性较差，且易发生退变［3］．软骨移植术或软骨膜移植术存在供区损伤、来源有限、移植骨软骨塌陷、操作复杂及技术要求高等缺点．值得注意的是，关节软骨损伤常伴有软骨下骨损伤，软骨下骨不仅对关节软骨起支持作用，而且还参与软骨和骨髓腔之间的营养物质交换．目前骨缺损的治疗方式包括自体或异体骨移植，以及生物材料的填充．然而自体骨移植存在来源有限、供区损伤和增加患者创伤和痛苦的缺点．异体骨移植也有与宿主存在排斥反应，移植骨来源受限，存活障碍等问题．不过可喜的是，随着组织工程学的兴起和发展，关节骨软骨缺损的修复将成为可能．

1 组织工程技术

骨与软骨组织工程的基本原理是从机体获取少量活组织作为种子细胞，将其体外扩增后按一定比例复合在具有良好组织相容性的支架材料上，构建组织工程化的骨与软骨并植入病损部位，以达到损伤修复和功能重建的目的，其包括三大要素：信号分子（成骨和成软骨生长因子）、成骨和成软骨相关种子细胞、支架材料．

1．1 种子细胞 目前研究较多的种子细胞包括骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、干细胞衍生的外泌体（stem cell-derived exosomes， SC-Exos）、脂肪干细胞、胚胎干细胞等．

骨髓间充质干细胞来源广泛、扩增能力强，且具有良好的软骨再生能力和多向分化潜能，具有较高的研究和应用前景．Jia等［4］制备出细胞外基质来源的软骨支架，并将 BMSCs种植于支架内，以此干细胞-支架复合体来修复兔子全层关节软骨缺损，结果表明，骨髓间充质干细胞以细胞外基质来源的软骨支架为载体，在其中黏附、增殖并分化成软骨细胞，成功修复软骨缺损．然而，健康的骨髓间充质细胞并不容易获得，从老年人或患者供体中提取出来的BMSCs进行体外培养时，有时会出现细胞形态的异常，黏附、分化、增殖能力下降［5］．因此，寻找具有可获得性、可扩增性和多相分化潜能的新种子细胞已是细胞生物学的研究热点．

卫星细胞或早期肌肉祖细胞具备在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）或转化生长因子-β3（transforming growth factor-β3， TGF-β3）刺激下分化为软骨的能力［6－8］．其中肌肉干细胞（musclederived stem cells，MDSCs）表现出多相分化潜力和较强的增殖能力．研究［9］表明，体外培养中，利用BMP-4或TGF-β1刺激肌肉干细胞可促使其增殖并分化为软骨样组织．深入探究BMP-4／TGF-β1刺激 MDSCs分化为软骨组织的影响因素及具体机制可以为组织工程技术治疗关节软骨缺损提供新的思路和技术手段．然而干细胞在软骨再生过程中有时可以观察到新生成组织的肥大和骨化，这是研究者所不希望看到的现象［10－11］．同时，干细胞在多次传代后进行体外培养时，常出现异常的细胞形态，且其分化增殖和生存能力下降．

最新研究［12－15］发现，干细胞并不是直接增殖、分化成软骨组织，而更可能是通过旁分泌形式分泌细胞外囊泡的方式发挥功能．SC-Exos是一种含有各种核酸和蛋白质的纳米级细胞外囊泡，可以诱导周围细胞发生遗传变化，并起调节作用，如促进其增殖或抑制细胞凋亡．以上研究说明，若SC-Exos在软骨缺损部位保持其有效浓度，SC-Exos便会诱导周围软骨细胞迁移至生物支架和SC-Exos巢中，促进软骨细胞增殖，从而持续有效地修复和再生软骨组织．Liu等［5］研制了一种新的光诱导亚胺交联（phototriggered imine corsslink，PIC）水凝胶并将SC-Exos封装于其中，制备出无细胞水凝胶组织贴片（EHG），EHG组织贴片可以与天然软骨无缝贴合，有效地保持SC-Exos在缺损部位的局部浓度，使SC-Exos不会被机体快速清除，从而发挥其功能，促进软骨修复和再生．相比于干细胞移植修复软骨缺损，EHG作为一种新型的无细胞支架材料避免了直接细胞移植的安全性问题，同时SC-Exos比干细胞更易被制造、表征、储存和处理．因此，SC-Exos显示出取代干细胞治疗关节软骨缺损的巨大潜力，具有极高的学术研究价值和应用前景．

1．2 生长因子 虽然干细胞对于骨软骨缺损的修复是部分有效的，但在缺损区域干细胞的增殖、分化能力有限，故其分化成为骨或软骨细胞具有一定挑战性［16］．因此，探索出对细胞增殖有调节作用的细胞因子已经成为骨软骨组织工程的重要环节．BMP、TGF、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子等在骨软骨缺损的修复过程中发挥了重要作用．其中，BMP-2成骨潜力巨大，是促进骨骼再生的关键因素［17－18］．Zhao 等［19］将聚多巴胺（poly dopamine，PDA）涂覆在PLGA／HA支架上以固定BMP-2并改善支架材料的细胞附着力，使BMP-2可以在骨缺损区域长期保持调节作用．研究显示在固定BMP-2后，通过显著增加ALP活性、钙沉积和成骨相关基因表达，支架表现出优异的生物活性，增强MC3T3-E1细胞的成骨分化．然而，BMP-2在生理条件下容易从支架上脱落，并不总是保留骨再生活性［20］，这也限制了其在骨软骨组织工程的进一步应用．VEGF在骨髓生长板中对软骨形成和分化起关键作用，这对于软骨细胞的增殖至关重要［21］．An等［22］制备明胶／PLGA纳米复合支架并将 VEGF和BMP加载在支架中，使生长因子在修复骨软骨缺损可以持续释放．结果显示，VEGF和BMP可以促进BMSCs 在支架上的黏附、增殖和分化．有证据［23－24］表明TGF-β通过Smad2／3，MAPK通路上调局部环境中有助于促进软骨形成的各种因素，促进软骨细胞的增殖，是软骨再生的合成代谢因子．然而TGF-β1仅可促进成骨的早期阶段，并且在没有BMP的情况下，TGF-β1不能促进 BMSCs分化成成骨细胞［25］．故单纯应用一种生长因子往往达不到同时促进骨相层或软骨相层增殖的目的．

1．3 支架材料与制备工艺 种子细胞功能的发挥需要细胞外基质的存在，因此细胞外替代物（即种子细胞的生物支架材料）的选择至关重要．而生物支架的制备工艺更是影响支架的外型、大小、结构分布等机械特性．这对于支架能否营造出适合种子细胞的增殖生长环境来说至关重要．

1．3．1 生物支架 组织工程的生物支架不仅影响种子细胞的生物学特性和培养效率，而且决定移植后能否很好地和受体结合起来，从而发挥其修复损伤的作用．关节软骨损伤常伴随软骨下骨损伤，软骨下骨不仅对关节软骨起支持作用，而且还参与软骨与骨髓腔之间的营养物质交换，因而临床修复关节软骨包括了关节面软骨的再生和软骨下骨的修复．故对于组织工程技术来说，种子细胞的支架材料在结构和组成上的设计应符合临床治疗的需求．

目前，关节软骨缺损修复使用三维支架的研究仍处于初级阶段，已有研究文献报道的支架类型从结构上大致分为以下四类，如图1所示．

图1 修复关节软骨与软骨下骨缺损用支架示意图

1．3．1．1 单相支架 单相支架（图 1D）是采用单一材料根据缺损区形态预先成型再填充而形成的，是组织工程最早应用于骨软骨缺损修复的支架［26］．研究［27－28］表明，制备单相支架的常用材料包括羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）及一些聚合物，如PLGA和聚己酸内酯等，这些材料具有良好的降解率，生物相容性，不同的孔隙率和强度，可以模拟周围组织特性，从而促进与宿主组织的充分整合．Zhou等［29］设计单相胶原（collagen，COL）支架和双相胶原羟基磷灰石（collagen hydroxyapatite， COL-HA）支架，对比并评价其对人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）分化为软骨细胞和骨细胞的能力．MTT实验结果显示两种支架均可促进hMSCs分化为软骨细胞和骨细胞．两种支架复合hMSCs后在成软骨细胞培养基中培养3周后，阿尔新蓝染色以及免疫组织化学染色呈阳性表达；而在成骨细胞培养基中培养3周后，茜素红和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性．结果显示，单相胶原支架在成软骨方面表现良好，而双相COL-HA支架在成骨方面更具优势．以上研究表明，单相支架可为软骨细胞或骨细胞的黏附和增殖提供良好的条件，但软骨细胞和骨细胞增殖所需要的生长环境（细胞外基质）不同，单相支架往往不能同时提供骨细胞与软骨细胞生长所需的环境，同时单相支架的抗压强度相对不足，也在一定程度上降低了其在治疗关节骨软骨缺损的效果．

1．3．1．2 双相支架 双相一体化支架的上层和下层分别可植入骨细胞和软骨细胞，或两层植入同一干细胞以构建骨软骨复合体．图1C中的双相一体化支架是根据术中预先钻洞的形状尺寸进行设计的，外形匹配良好且非均相支架的骨相部分嵌入缺损处不易发生滑移［30］．一般来说，非均相支架的骨相部分材料具有良好的生物活性，可通过类骨磷灰石的沉积与周边骨组织产生稳固的键合，为整个修复过程提供稳定支撑［31］．Fu 等［32］证实生物玻璃可作为双相支架骨相部分的材料，其表现的抗压强度（136±22）MPa可比拟人体的皮质骨．其他材料如羟基磷灰石［33］、β-三磷酸钙（β-tricalcium phosphate， β-TCP）［34］及可降解聚合物的复合体［35－36］．对于非均相支架的软骨相部分，支架材料的选择多为各类聚合物，包括人工合成的聚合物如聚乳酸、聚氨酯等，以及两种或多种高分子复合物．天然高分子如胶原蛋白、丝素蛋白和藻酸盐［37］、透明质酸［38］、几丁质［39］等多糖类高分子水凝胶．丝素蛋白作为一种天然材料，拥有高韧性、来源丰富、价格低廉等优势，与胶原蛋白相比具有较低的抗原性和良好的生物相容性，同时它继承了胶原蛋白的优越性能，可以促进细胞黏附和软骨形成，是支架软骨相材料的不二之选［40－41］．Yan 等［40］完全整合丝素蛋白和纳米碳酸钙层构建出新型的多孔双层支架，并将兔骨髓间充质干细胞整合到支架内，植入膝关节骨软骨缺损的新西兰大兔中，9周后观察发现复合支架于宿主骨组织紧密贴合，丝素蛋白层可促进软骨再生，纳米碳素钙层可见大量软骨下骨向内生长并有血管生成．说明丝素蛋白／纳米碳酸钙双层支架对于骨软骨缺损有修复作用．但丝素蛋白仍有缺陷，如快速降解、强度不足．甚至有研究［42－44］发现丝素蛋白材料内长入的细胞较少，甚至有的细胞无法长入．双相支架提供了软骨细胞和骨细胞增殖所需要的生长环境，避免了单相支架的不足，满足软骨和软骨下骨不同组织的生长要求．然而双相支架的骨和软骨界面（致密钙化层）结合欠佳，缺少修复致密钙化层的材料，而钙化层是连接软骨和软骨下骨的重要界面结构．钙化层的缺失可能会引起关节生物力学分布不均衡以及组织液循环障碍，不利于骨软骨缺损的修复．

1．3．1．3 三相一体化支架 关节软骨损伤常伴有软骨下骨和钙化层的损伤．钙化层是关节软骨深层的高度矿化区域，是非钙化软骨和软骨下骨之间重要的界面结构，有着抵抗剪切力、分散横向应力、紧密连接骨软骨以及限制组织液在骨软骨界面自由交换等作用［45］．在软骨缺损的修复过程中，透明软骨与软骨下骨的有效整合在一定程度上有助于软骨缺损的治疗，而钙化层为透明软骨和软骨下骨的机械整合提供保障．因此临床修复关节软骨要注重关节面软骨和软骨下骨的再生，同时也要强调钙化层的修复．魏戎等［46］利用快速成型技术在三维立体包芯结构骨架表面喷涂乳酸-羟基乙酸共聚物／β-磷酸三钙有机溶液，形成0．5 mm的致密层；再将骨软骨支架与致密层紧密连接制备出致密层骨软骨复合支架，用以修复新西兰大白兔骨软骨缺损，24周后实验结果显示缺损区域被透明软骨样组织覆盖，表明平整．对于非均相支架等骨相部分材料来说，介孔生物玻璃（mesoporous bioactive glasses，MBG）较传统方法制备的生物玻璃具有更好的沉积羟基磷灰石的能力［47］，将MBG粉末整合于三维支架中，可以提高支架的机械性和强度［48－50］．对于非均相支架的软骨相部分，水凝胶由于其高含水量、良好的生物相容性、可操作性和强组织黏合力等特点而被广泛应用于制作软骨再生的支架材料［51－52］．而研究［37］显示海藻酸盐作为一种天然多糖分子，在构成软骨和骨组织修复支架时，可促进BMSCs和软骨细胞的增殖，填充缺损并且刺激新组织再生．将水溶性的海藻酸盐与阳离子交联制备出海藻酸盐水凝胶表现出一定的强度和促进软骨细胞增殖的能力．三相支架体现了正常组织结构分布的软骨、致密钙化层、软骨下骨的解剖分层，更符合组织工程骨软骨复合支架的要求．

1．3．2 制备工艺 随着新材料的不断开发，关节软骨支架研究所面临的核心挑战开始向支架结构和制备工艺上转移．支架的孔径和3D空间结构是透明软骨再生过程中细胞增殖、分化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）生成的关键因素．其中，孔隙率在250～500 μm的支架不仅可以让细胞获得更好的增殖条件以及ECM分泌能力，还可以提供血管再生所需要的空间，有利于营养物质的运输和气体交换，这对于细胞的黏附、迁移和增殖有着积极的作用［53］．传统的支架制备方法如发泡法、粒子滤取法、冷冻干燥法、模板法等可以制备出多孔生物可降解支架．其中发泡法的基本原理是在前体溶液中诱导产生惰性气体（二氧化碳或者氮气），形成的气体混合于液体中并转化为泡沫体；随后降低温度来稳定泡沫，从而制备出多孔支架．Poursamar等［54］以胶原为支架底物，利用发泡法制备多孔支架，以戊二醛（glutaraldehyde，GTA）作为交联剂来稳定并调整支架的机械性，结果表明，发泡法可以制备出良好生物相容性和适宜孔隙度的支架，以满足干细胞的粘附、生长要求．但值得提出的是，虽然发泡法在生物相容性和支架孔隙度方面显示出一定的优越性，但是其制备的支架生物力学强度不尽人意，这也限制了发泡法在制备多孔隙支架方面的进一步应用．而粒子滤取法、冷冻干燥法、模板法在支架孔隙尺寸和连通性的精确控制上受到限制，并且制备支架所使用的有机溶剂可能对细胞的生长产生危害，而人体关节软骨组织结构复杂，因此这些传统方法在制备由多种材料不同结构的各相层组成的非均相支架方面仍存在缺陷．近年来，随着3D打印技术的快速发展，采用3D打印技术制备多孔隙支架已成为研究热门．3D打印技术是根据计算机设计的CAD三维模型或是临床CT／MRI三维重建数据，3D打印可精确定制外形和尺寸符合需要的植入体．另外，从非均相支架的制备角度来说，3D打印使用的墨水即为支架材料，在层层堆积成型的过程中，各层相的孔道结构也可通过沉积纤维束的粗细、间距和排列方式调节，从而达到运用不同材料打印出不同结构非均相支架的目的．运用3D打印技术制备的支架材料，不仅外形可控，其内部孔隙结构、大小、分布亦简单易调，而且支架材料的组合自由多样，可以实现骨与软骨组织在结构和组份上的高度模拟．因此，利用3D打印技术对具有可靠空间结构、良好的机械性能和生物相容性的组织工程骨架制造的研究具有重要的实践意义．

2 存在的问题和展望

目前，组织工程技术无论在种子细胞的选取还是支架材料的探索开发以及制备工艺上都取得了显著的进步，但仍存在一些亟待解决的问题：①如何选取来源丰富、增殖能力旺盛且生存能力强大的干细胞？对于SC-Exos治疗关节软骨缺损的体内体外生物学效能评价还需进一步研究．②如何加载细胞因子于支架上使其发挥控释或者缓释作用，从而完善干细胞在体内的增殖环境？③如何选取支架的各层材料（包括软骨相层、致密钙化层和骨相层）并精确可控制备出组成和结构均不相同的三层非均相支架？④如何牢固联结三相支架的各相层使其趋于一体化，并防止层间磨损和滑脱？深入探索并解决这些问题可以为组织工程骨软骨复合支架的制备提供新的方法和思路，有望为关节软骨和软骨下骨的同时修复及关节生理功能重建带来新的生机，具有较高的学术研究价值和广阔的临床应用前景．

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Research advances in tissue-engineering techniques in thetreatmentofosteochondral defects

HU Hong-Xing1， BU Zi-Heng2， LIU Zhong-Tang21Department of Orthopedics， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou MedicalUniversity， Wenzhou 325027， China；2Department of Joint Surgery，Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

The treatment of osteochondral defects is a major challenge in orthopedic surgery，while the development of tissue engineering techniques bring new hope for it．This study investigated the application of tissue-engineering scaffolds material in the treatment of osteochondral defects．The related articles addressing tissue-engineered techniques in the treatment of osteochondral defects were retrieved by searching in PubMed，CNKI and Wanfang database with such key words “osteochondral defects，scaffolds， 3D-printing”．Finally， 54 eligible literatures were included．The conclusions are as follows： ①The seed cells include bone mesenchymalstem cells， muscle stem cells， SC-Exos，adipose-derived stem cells， embryonic stem cells and so on．SC-Exos shows the potential for the replacement of stem cells in the treatment of articular cartilage defects．②Growth factors such as BMP， TGF， VEGF and IGF play an important role in the repair of osteochondral defects．③The single layer scaffold and bi-layer scaffold have some shortcomingsin the repairof osteochondral defects，while compared with the nature bone cartilage structure，tri-layer scaffold is more consistent with the requirements of tissue engineering osteochondral composite scaffold．④Compared to traditional methods such as foaming，particle filtration， freeze-drying， template method， 3D printing technology has a certain advantage in the preparation of multi-phase scaffolds．

osteochondral defects； tissue-engineering techniques； 3D-printing； SC-Exos

骨软骨缺损的治疗一直是骨科医生面临的棘手问题，组织工程学的发展为其治疗带来了新的希望．本研究探讨了组织工程材料治疗骨软骨缺损的研究进展．在中国知网、PubMed和万方数据库中以“骨软骨缺损，组织工程支架，osteochondral defects，cartilage repair，scaffold，3D-printing”为检索词检索关于组织工程材料治疗骨软骨缺损的相关文献．最终选择54篇文献进行综述，得出以下结论：①种子细胞包括骨髓间充质干细胞、肌肉干细胞、干细胞衍生的外泌体（SC-Exos）、脂肪干细胞、胚胎干细胞等．SC-Exos显示出取代干细胞治疗关节软骨缺损的巨大潜力．②骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子等生长因子在骨软骨缺损的修复过程中发挥了重要作用．③单相和双相支架在骨软骨缺损修复中存在缺陷，而三相支架比拟天然骨软骨结构更符合组织工程骨软骨复合支架的要求．④3D打印技术在制备多相层支架相比于传统方法如发泡法、粒子滤取法、冷冻干燥法、模板法等具有一定优势．

骨软骨缺损；组织工程技术；3D打印；外泌体（Exos）

R318

A

2095-6894（2017）12-11-06

2017－05－11；接受日期：2017－05－28

国家自然科学基金面上项目（51673212）

胡宏悻．硕士生．研究方向：关节外科及运动医学．E-mail：jayden＿hu0422＠ 163．com

刘忠堂．博士，教授，主任医师．E-mail：surgeon＿liu＠ 163．com