金银花露残液提取物抑菌活性的研究

张思远，徐一芩，张锦涛，吴 伟,2*

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,湖北 黄州 438000)

金银花露残液提取物抑菌活性的研究

张思远1，徐一芩1，张锦涛1，吴 伟1,2*

(1湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003；2黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,湖北 黄州 438000)

以金银花露生产残液为材料，经超滤膜过滤处理后，采用NKA-9大孔树脂进行纯化，再分别用10%和50%乙醇水溶液(V/V)进行洗脱，依次得到一定纯度的金银花露残液提取物绿原酸和粗黄酮。检测了2种提取物的抑菌活性，并对其在浓度、温度等因素下的抑菌活性进行了探讨。结果表明，金银花露生产残液提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母生长有明显的抑制作用，且粗黄酮的抑菌活性强于绿原酸，与常用防腐剂苯甲酸钠的抑菌作用相比效果明显；提取物经高温处理后仍具较强的抑菌活性。该研究为金银花露残液的综合回收利用提供了理论依据。

金银花露残液；提取物；抑菌活性

金银花(Flos lonicerae)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(Lonicera japonica thunb)及同属多种植物的干燥花蕾，是一种“药食同源”的绿色天然产物，为中医常用药，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能[1]。金银花中主要含挥发油类、绿原酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜类及无机元素。其中黄酮类化合物包括木犀草素-3-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、忍冬苷、5-羟基-3',4',7-三甲氧基黄酮和紫堇黄酮等[2]。早期研究认为绿原酸是金银花的主要活性成分之一，其含量被作为评价金银花药材品质优劣的指标。随着研究的深入，发现黄酮类化合物也是金银花的有效成分之一，其含量也应成为金银花质量的评价指标。

目前，国内外都在大力开发高效、低毒、广谱和经济实用的防腐剂。从有关植物中提取有效抑菌、防腐安全性高的活性成分，开发天然防腐剂代替化学合成防腐剂是当今研究热点之一[3-6]。金银花中含有丰富的药用活性成分，主要为绿原酸和黄酮类化合物等。湖北省拥有丰富的金银花资源，但金银花深加工企业主要生产金银花露，而金银花露残液作为金银花饮品加工的副产物之一，多数都没有得到较好地回收及综合利用，直接被废弃，势必造成了自然资源的极大浪费。

大量研究表明，绿原酸和黄酮类物质均具有一定的抗菌活性[7-9]。本实验拟采用微生物学实验方法，研究金银花露残液提取物的抗菌功效，以及有关理化因素对其抗菌活性的影响，阐明其抗菌特性，为金银花露残液的回收及综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花露残液，由湖北楚天舒药业有限公司提供。

苯甲酸钠(分析纯)和氯化钠(分析纯)均购于天津市凯通化学试剂有限责任公司。实验用水均为蒸馏水。

1.2 供试菌种

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和啤酒酵母均系湖北理工学院医学院微生物实验室保存菌种。

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：取营养琼脂培养基32 g，水1 000 mL，加热溶化，调pH值为7.4～7.6。

以上培养基分装三角瓶，均在121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至50～60 ℃，备用。

1.4 主要仪器

电热恒温培养箱，长沙华曦电子科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FA1004N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.5 金银花露残液中药用成分的分离纯化

取金银花露生产残液100 mL，过滤，滤液中加入蒸馏水200 mL，经过超滤膜过滤处理后得到滤液约300 mL。将滤液pH值调节为5后上样到NKA-9大孔树脂，用10%乙醇水溶液(V/V)洗脱，流速为每小时2柱体积；再用50%乙醇水溶液(V/V)洗脱，流速为每小时1柱体积，分别收集洗脱液。在65 ℃，0.09 MPa下减压浓缩至膏状；在65 ℃，98 kPa下真空干燥，分别得到一定纯度的绿原酸和粗黄酮。

1.6 菌悬液的制备

细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，将供试菌种分别接种到装有对应培养基的试管内，37 ℃培养24 h。取活化好的菌种斜面，挑取3～4环菌体或孢子放入装有50 mL无菌生理盐水的小锥形瓶里，充分振摇10 min配制成约(1～10)×106CFU/mL的菌悬液，备用。

1.7 抑菌实验

将绿原酸和粗黄酮用无菌水稀释，每一菌株配置7个梯度浓度。将不同浓度的试液分别定量加到热溶解后的琼脂培养基中，混匀，制成分别含有绿原酸或粗黄酮0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL的7个不同的培养基平皿。在以上培养基平皿中，分别涂布各菌株的菌液，置于37 ℃恒温箱中培养24 h。并以未加提取物的培养基作为空白对照，加常用防腐剂苯甲酸钠溶液(0.1%)的培养基作为阳性对照。观察各平皿的菌落生长情况，确定出绿原酸和粗黄酮的最低抑菌浓度(MIC)。以平板菌落计数法进行计数。为保证所测数据的精确性，每种菌做3个重复实验。抑菌率(%)=(1-TX/T0)×100%，式中，TX表示各对应绿原酸和粗黄酮浓度的菌落数，T0表示空白对照皿的菌落数。以完全无菌生长的最低浓度作为金银花露残液提取液最低抑菌浓度，由此测出每种菌种的最低抑菌浓度MIC。

2 结果与讨论

2.1 金银花露残液提取物中绿原酸的体外抑菌实验

绿原酸的体外抑菌实验结果见表1。由表1可看出，金银花露残液提取物中绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用，就酿酒酵母而言，抑制活性与苯甲酸钠相当。绿原酸对4种菌的抑制活性强弱顺序依次为：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母。由此证明，金银花露残液提取物中的绿原酸成分，对于常见的食品污染微生物具有一定的抑菌活性，特别是对于细菌的抑菌作用，与常用防腐剂苯甲酸钠的相比效果明显。

表1 绿原酸的体外抑菌实验结果

2.2 金银花露残液提取物中粗黄酮的体外抑菌实验

粗黄酮的体外抑菌实验结果见表2。由表2可看出，金银花露残液提取物中粗黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用，就酿酒酵母而言，抑菌活性略强于苯甲酸钠。对比表2与表1的结果发现，粗黄酮对3种细菌的抑制活性要强于绿原酸，对于大肠杆菌，粗黄酮的抑菌活性是绿原酸的2倍，对于金黄色葡萄球菌表现为1.6倍，对于枯草芽孢杆菌表现为1.25倍。 由此证明，金银花露残液提取物中的粗黄酮成分，对于常见的食品污染微生物具有一定的抑菌活性，特别是对于3种细菌的抑菌作用，与常用防腐剂苯甲酸钠相比效果明显。

表2 粗黄酮的体外抑菌实验结果

2.3 温度对金银花露残液提取物抑菌活性的影响

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌，不同温度下处理绿原酸(0.05 mg/mL)和粗黄酮(0.02 mg/mL)一定的时间，测定抑菌活性。温度对金银花露残液提取物抑菌活性的影响见表3。

表3 温度对金银花露残液提取物抑菌活性的影响

由表3可以看出，金银花露残液提取物经不同温度处理后其抑菌活性有一定差异，在未加热处理时，抑菌活性最高，说明在接近室温的条件下金银花露残液提取物能发挥较好的抑菌作用。提取物在121 ℃下灭菌20 min后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性增加幅度明显，但不呈线性关系。推测可能是加热过程中，不同成分间发生一系列的化学反应，生成了新的抗菌物质，而不同微生物对这类物质的耐性有差异。结果表明金银花露残液提取物的抑菌活性物质具有较高的热稳定性。

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Study of Antibacterial Activity of Extracts from Lonicera Japonica Thunb Residual Liquid

ZhangSiyuan1,XuYiqin1,ZhangJintao1,WuWei1,2*

(1School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003;2Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization,Huanggang Normal University,Huangzhou Hubei 438000)

Lonicera japonica thunb residue liquid was tested in this study,which was treated with ultrafiltration membrane and then purified with NKA-9 macroporous resin.Elution was carried out with 10% and 50% aqueous ethanol(V/V),respectively,to obtain a certain purity of chlorogenic acid and crude flavonoids.The antibacterial activities of the extract with diferent concentrations and temperature against the four kinds of bacteria were determined.The results showed that the extracts inhibited the growth of Staphylococcus aureus,Escheichia coli,Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae eficaciously,and flavonoids were better than chlorogenic acid.The extract was stable when treated at high temperature.This study provides a theoretical basis for the comprehensive recovery and utilization of Lonicera japonica thunb residual liquid.

lonicera japonica thunb residual liquid;extracts;antibacterial activity

2017-05-23

经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室开放基金项目(项目编号2017BW02)；湖北理工学院校级科研重点项目(项目编号17xjz07A)。

张思远，本科生。

*通讯作者：吴伟，副教授，博士，研究方向：生物技术制药。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.06.013

Q932

A

2095-4565(2017)06-0057-03

(责任编辑吴鸿霞)