基于向量-子空间夹角判据分析饮料中的咖啡因

忻欣，刘柳，韩莹，徐传杰，粟晖，姚志湘

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；3.广西壮族自治区计量检测研究院，广西南宁530007）

基于向量-子空间夹角判据分析饮料中的咖啡因

忻欣1，刘柳2，*，韩莹1，徐传杰3，粟晖2，姚志湘2

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；3.广西壮族自治区计量检测研究院，广西南宁530007）

基于"向量-子空间夹角"判据，建立了饮料中咖啡因的快速分析方法。通过色谱-光谱联用采集功能饮料和碳酸饮料的紫外多波长光谱三维数据，构建不含被测组分咖啡因的功能饮料和可乐三维本底光谱数据库，基于向量-空间夹角法步骤测定了批量饮料样本中咖啡因含量。结果表明：该方法计算结果和高效液相色谱分析结果接近，相对误差小于4.0%，市售样品加标回收率在96.7%～106.0%，RSD值小于2.0%。分析模型建立后，只需采集饮料的紫外光谱即可完成分析。建立的方法快速、准确，可为饮料的现场分析提供可行方案。

向量-子空间夹角；判据；咖啡因；饮料

咖啡因（C8H10N4O2）是一种黄嘌呤生物碱化合物，具有扩张血管，兴奋中枢神经等功能。咖啡因被广泛添加到功能型饮料和可乐型饮料中，其含量是衡量饮料品质的重要指标。

咖啡因的分析检测，通常采用的有紫外分光光度法[1]、高效液相色谱法[2-3]、近红外光谱法[4]和拉曼光谱法[5]等。高效液相色谱法具有操作简便、灵敏度高等优点，但存在分离时间长，大批量样本的分析效率低、操作强度大、试剂损耗大，分析成本高，紫外光谱法对于多组分同时有紫外响应的体系难以准确定量分析，近红外光谱分析需要进行大量模型建立工作，因此有必要研究一种快速简便的分析方法。近年来分析化学已经不再是依赖物质消耗手段来获取信息，而是逐步发展成为化学信息科学[6]。目前的化学计量学研究对稳健性的关注主要在于样本数据的多态和异常值（multimodality，outliers）[7]，建模样本直接关系到模型的稳健性，即使是相同体系，在很多情况下模型对数据变化敏感，也就是说，稳健性仍然是一个关键问题[8]。

姚志湘等提出基于体系对应的子空间判断比基于样本的矩阵特征判断具有更好的稳健性。当被测组分存在于体系时，该组分向量与体系子空间的夹角为零，反之夹角存在，向量-子空间夹角是一个子空间判断依据。基于该判据，提出了一种混合一维谱的定量方法，在化妆品中对羟基苯甲酸酯[9-10]、酱油中山梨酸钾[11]以及果冻中的色素和防腐剂[12]等测定中应用，分析速度快，测定结果的精密度和准确度满足定量分析要求。方法不需要严格的秩估计，对样本背景波动不敏感，具有较好的稳健性。

本文首先构建咖啡因标准紫外光谱数据库和饮料紫外光谱数据，然后通过对市售不同功能性饮料进行一次高效液相色谱-光谱仪联用，采集各样品经色谱分离后的三维紫外光谱数据，经数据处理获得不含被测组分咖啡因的本底光谱数据阵列，结合空间夹角判据算法（简称VS法）可实现直接分析待测样本中咖啡因含量。

1 仪器与试剂

2 实验部分

2.1 建立咖啡因标准品的标准光谱库（v）

分别精确称取0.020 0 g咖啡因标准品于25mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容。分别稀配制成系列浓度为 4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mL 的咖啡因标准品溶液B1-B9，并采集多波长紫外光谱，经最小二乘回归得到标准光谱库v。

2.2 建立功能饮料、可乐样本的光谱数据（a）

分别取市售可乐样品1和可乐样品2超声20分钟脱气后，用二次蒸馏水稀释10倍，得到待测（可乐）样本S1和S2，另取功能性饮料用二次蒸馏水稀释20倍得到S3。用紫外-可见光纤光谱仪采集200 nm～1 100nm多波长光谱数据，即获得样本光谱数据a1-a3。

2.3 建立饮料本底光谱数据库（N）

对待测样品S1-S3和咖啡因标准品B5，通过液相色谱与光谱仪联用，采集各样本经过色谱柱完全分离后的多波长光谱数据。从待测样品光谱数据中扣除待测组分咖啡因的光谱数据，并经数据降维[5]，得到本底光谱数据库N。

液相色谱条件：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；270 nm；

流动相为

0.01min～13.00min，乙腈：0.02mol/LH3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=15 ∶85（体积比）；13.01min～25.00min，乙腈：0.02 mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=15∶85（体积比）；25.01min～45.00min，乙腈：0.02 mol/L H3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=35∶65（体积比）；45.01min～60.00min，乙腈：0.02mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=40∶60（体积比）。

妇科共有30名护理人员,护理人员均为女性,年龄范围20~35岁,平均(27.5±5.4)岁,工作时间1~14年,平均(7.5±1.9)年,学历在本科以上20人(66.6%)、专科5人(16.7%)、中专5人(16.7%),其中副主任护师3人,护士主管10人,护师及护士共17人。

柱温：30 ℃；流速 1mL/min；进样量：20 μL。

紫外-可见光纤光谱仪光谱条件：流动比色皿（1 cm）；积分时间：15微秒；积分次数：20次；紫外检测波长：200 nm～400 nm。

2.4 待测样本中咖啡因含量测定

将上述标准光谱数据库v，本底光谱数据库N以及a导入计算平台，选取200 nm～400 nm波长段，应用向量-子空间夹角判据算法分别计算各待测样本中咖啡因的含量。

2.5 加标回收率试验

将功能饮料样品稀释20倍，将可乐样品稀释10倍后，分别加入一定量的咖啡因标准品，测定其多波长紫外光谱数据，采用向量-子空间夹角判据计算样品加标回收率。

2.6 精密度试验

取稀释后的功能饮料和可乐样品，在紫外-可见光纤光谱仪上检测重复测定3次，记录紫外-可见光谱数据，用向量-子空间法进行计算，检验方法的精密度。

3 结果与讨论

3.1 建立咖啡因标准品的标准光谱库

选择220 nm～350 nm波长范围光谱，对系列浓度为4μg/mL～20μg/mL的咖啡因标准品溶液的紫外光谱进行多变量最小二乘回归（Multivariate least-squares regression），得到咖啡因标准曲线，记为V。其中在270 nm处的线性方程、相关系数为：y=0.051 5x+0.030 3；r=0.999 1。

3.2 本底数据库的建立

图1、2、3分别为咖啡因对照品、功能饮料样本和可乐样品1样本在270 nm处的高效液相色谱图。经分析对比，图2、3中A为咖啡因，其他的色谱峰为样本中相对于咖啡因的本底物质。依次从各饮料样本的数据中扣除与咖啡因标准物具有相同保留时间的光谱数据后，将其余数据存入光谱数据库中构成数据库M。

图1 咖啡因对照品在270 nm处的高效液相色谱图Fig.1 Caffeine reference substance at 270 nm of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

图2 功能饮料样本的高效液相色谱图Fig.2 Red bull samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

图3 可乐样本的高效液相色谱图Fig.3 Coke samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

液相-光谱联用获取的初始本底光谱数据M数据量大，若直接采用，运算时间长，影响了方法的时效性，因此需要对获取的数据进行降维以去除数据中的噪声和冗余的维数，保留效性数据、并能够提高算法的处理速度。以某品牌功能饮料饮料为例，选用主成分分析[13-14]的方法判断体系主成份为5，如图4所示。

图4 二阶差分序列变化图Fig.4 Change of second difference successive value

应用[U，S，V]=svd（M）[6]对 M 进行奇异值分解降维，取降解后U矩阵的前5列，即为降维后的本地数据库N。

3.3 样品中咖啡因含量的测定

分别将本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及待测样本a1、a2、a3导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法计算功能饮料样本和可乐样本中咖啡因含量，结果见表1。

表1 两种方法测定市售饮料中咖啡因的含量Table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

续表1 两种方法测定市售饮料中咖啡因的含量Continue table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

以功能饮料稀释20倍后的样品为例说明含量测定的计算过程。

（1）精度设定扣减步长Δ=1 000；

（2）在算式yi=aix+bi中代入较大的x1值，得到v1，所述的yi表示在i波长下咖啡因的吸光度值，ai、bi是常数，x表示咖啡因的浓度，v1表示在浓度为x1时咖啡因的多波长吸光度值y1，v1为所有的yi值组成的矩阵；

（3）从功能饮料样本光谱数据a1中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为da1；把本底光谱数据库N和变量da1合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v1夹角；

（4）从功能饮料样本光谱数据a中逐步扣除v1后，重复步骤（3）；

（5）当功能饮料样品中的咖啡因完全被扣除后比对空间M和咖啡因的光谱向量v，空间夹角值会出现最大值θmax，记录空间夹角最大值θmax出现时对应的扣减步数λ（参见图5出现最大夹角是的扣减步数为959），这时通过咖啡因的浓度x1和扣减步数λ，计算饮料样本中咖啡因的含量y1=19.3×959/1 000，得到Y1即为待测饮料样品中咖啡因的含量值18.5μg/mL。

图5 功能饮料样本空间夹角值与扣减次数之间的曲线图Fig.5 Red bull vitamin drinks sample space angle values and curve between the numbers of deduction

从表1可知，采用向量-子空间夹角判据测定计算功能饮料、可乐样品1、可乐样品2中咖啡因含量，与高效液相色谱测定结果对比，相对误差基本小于±4%，说明向量-子空间夹角判据方法测定结果准确。

3.4 精密度试验结果

分别对功能饮料、可乐样品1、可乐样品2样本连续采集5次多波长光谱数据，按向量-子空间夹角判据进行计算，5次测定样品含量的平均值（C5）和相对标准偏差（RSD）如表2所示。试验结果表明相对标准偏差RSD小于2%，方法精密度好。

3.5 咖啡因本底加标样品的测定

在已知浓度的红牛维生素饮料和可乐饮料中，添加一定量的咖啡因标准品，选择210 nm～370 nm的紫外光谱进行空间夹角法进行运算，回收率为96.7%～106.0%，如表3所示，证明方法准确可靠。

表2 样品的相对标准偏差（n=5）Table 2 Relative standard deviation of samples（n=5）

表3 加标回收率Table 3 The recoveries of standard caffeine

4 结论

建立的饮料中咖啡因的快速分析方法满足定量分析需求，样品不需要复杂的前处理，对于同类饮料的测定，一次建库后无须再采用仪器联用进行本底光谱累积，即可对样品混合光谱中的待测组分进行快速、准确定量。方法具有操作简便，试剂消耗量小的特点。

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Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion

XIN Xin1，LIU Liu2，*，HAN Ying1，XU Chuan-jie3，SU Hui2，YAO Zhi-xiang2
（1.CSEPAT（Beijing）Technology Co.，Ltd.，Beijing 100029，China；2.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Metrology&Test，Nanning 530007，Guangxi，China）

According to Vector-subspace （VS）angle criterion，a new method of quick caffeine-analyzing in drinks is created.Using chromatography-mass spectrum analysis to collect UV multi-wavelength spectral databases of common functional drink and Cola，the background databases of functional drink and Cola without tested Caffeine were established，then Caffeine in Red Bulk and Cola was determinate based on Vector-subspace Angle Criterion.The results presented that analysis results were similar to that of High performance liquid chromatography（HPLC），the relative errors were less than 4.0%，the recoveries of standard caffeine which was added in Red bulk drink and Cola samples were in the range of 96.7%-106.0%and the relative stand deviation was less than 2.0%.After the background databases were established，the analysis could be achieved by only collecting the drinks'UV wavelength spectral.The method is rapid and accurate，which could provide the feasible solution to drinks'scene analysis.

vector-subspace；criterion；caffeine；HPLC；drink

忻欣，刘柳，韩莹，等.基于向量-子空间夹角判据分析饮料中的咖啡因[J].食品研究与开发，2018，39（1）：126-130

XIN Xin，LIU Liu，HAN Ying，et al.Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion[J].Food Research and Development，2018，39（1）：126-130

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.025

广西重点研发计划项目（桂科AB16380348）；柳州市计划项目（2015J030201）

忻欣（1983—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品科学与工程。

*通信作者：刘柳（1979—），女（汉），高级实验师，硕士，研究方向：过程分析技术。

2017-06-11