一种适用于HPLC去除血清中干扰峰的方法

赵静，陈才法，穆晶晶，韩玮璐，朱成雷，申蕊

（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116）

一种适用于HPLC去除血清中干扰峰的方法

赵静，陈才法，穆晶晶，韩玮璐，朱成雷，申蕊

（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116）

通过比较和优化血清样品制备方法，建立一种适用于HPLC去除血清中干扰峰的方法。运用盐析法、加热法、萃取法和有机溶剂法去除血清中干扰峰，经HPLC分析，比较4种方法对血清中干扰峰的去除效果。结果表明乙腈沉淀法能去除血清中大部分的蛋白质，留下很少的杂质峰；而加热法、萃取法和有机溶剂法均能去除血清中的杂质峰，但是留下的干扰峰较多，不适用于血清中HPLC的其他物质的检测。乙腈沉淀法去除血清中的杂质峰效果最好，干扰最小，为HPLC血清中杂质峰的排除提供了一种优化的方法。

HPLC；血清；杂质峰；盐析法；有机溶剂沉淀法；萃取法；加热法

随着高效液相色谱分析鉴定技术的飞速发展，高效液相色谱分析分离样品的高纯度和高浓度已越来越重要，而血清中众多高、中丰度蛋白的存在严重干扰小分子蛋白质的分离检测和鉴定[1]。因此，更好地分离检测复杂蛋白质是血清中去除杂质的关键。在现代药物分析工作中，80%左右的工作量及研究经费用于生物样品的前处理及制备步骤[2]。本文基于血清中复杂蛋白质的去除，探讨了盐析法、加热法、萃取法和有机溶剂法去除血清中干扰峰的最优方法，寻找一种适用于HPLC去除血清中杂质峰的最优方法。

1 材料和方法

1.1 实验样品

血清，为徐州医学院提供新生胎儿血清。

1.2 主要仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998紫外-可见光电二极管阵列检测器，HH-2恒温水浴锅（江苏省金檀市佳美仪器厂），TGL-16高速冷冻离心机，德国赛多利斯BP211D电子天平，HG-60旋涡混合器（北方同正生物技术发展公司），GM-0.33A隔膜真空泵，SZ-97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 主要试剂

乙腈、甲醇、磷酸、硫酸铵、乙酸乙酯，均为分析纯；所用的三蒸水为自制三蒸水。

1.4 液相色谱检测条件

色谱柱innoval C18，5μm，4.6×150mm；柱温：30℃；检测器及波长：Waters 2489 UV/Vis检测器，278nm；流动相A：1%磷酸/水溶液（体积比），过0.22μm水系微孔过滤膜；流动相B：1%磷酸/乙腈溶液（体积比）；流动相流速：1mL/min；梯度条件：0～15min，A相从95%线性变化至55%，保持5min后，5min内变为95%并平衡5min，共30min。

1.5 方法

1.5.1 盐析法去除干扰峰[3]

将0.5mL新生胎儿血清放入1.5mL离心管中，向离心管加入0.18g硫酸铵用旋涡混合器混匀，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min，吸取上清液置85℃水浴锅蒸干后用0.5mL甲醇复溶，用旋涡混合器混合1min使其充分溶解后，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min后，取上清，用0.22μm的过滤器过滤，然后取200μL放入进样瓶套管中，装入进样瓶后放入HPLC的进样盘中，进行检测。结果如图2所示。

1.5.2 加热法去除干扰峰

将0.5mL新生胎儿血上清放入1.5mL离心管中，水浴锅温度升至95℃时将离心管放入恒温水浴锅中，加热5min后加入乙腈，后取上清，用0.22μm的过滤器过滤，然后取200μL放入进样瓶套管中，装入进样瓶后放入HPLC的进样盘中，进行检测。结果如图3所示。

1.5.3 萃取法去除干扰峰[4]

取0.3mL新生胎儿血清放入离心管后加入0.3mL的乙酸乙酯萃取，用旋涡混合器混匀，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min，吸取上清液置85℃水浴锅蒸干后用0.5mL甲醇复溶，用旋涡混合器混合1min使其充分溶解后，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min后，取上清，用0.22μm的过滤器过滤，然后取200μL放入进样瓶套管中，装入进样瓶后放入HPLC的进样盘中，进行检测。结果如图4所示。

1.5.4 有机溶剂法去除干扰峰[5]

方法一：取0.3mL新生胎儿血清放入离心管里，加入0.3mL甲醇后用旋涡混合器混匀，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min，吸取上清液置85℃水浴锅蒸干后用0.5mL甲醇复溶，用旋涡混合器混合1min使其充分溶解后，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min后，取上清，用0.22μm的过滤器过滤，然后取200μL放入进样瓶套管中，装入进样瓶后放入HPLC的进样盘中，进行检测。结果如图5所示。

方法二：取0.3mL新生胎儿血清放入离心管里，加入0.3mL乙腈后用旋涡混合器混匀，静置1min后，16 000r/min 4℃冷冻离心10min，吸取上清液置85℃水浴锅蒸干后用0.5mL甲醇复溶，用旋涡混合器混合1min使其充分溶解后，静置1min后，16 000r/min4℃冷冻离心10min后，取上清，用0.22μm的过滤器过滤，然后取200μL放入进样瓶套管中，装入进样瓶后放入HPLC的进样盘中，进行检测。结果如图6所示。

2 结果

图1 原血血清中检测色谱图

图2 原血血清经过硫酸铵处理过后的色谱图

图3 原血血清经过加热后经过乙腈处理后的色谱图

图4 原血血清经过乙酸乙酯萃取后的色谱图

图5 原血血清经过甲醇处理后的色谱图

图6 原血血清经过乙腈处理后的色谱图

图1为不经处理的原血血清检测色谱图。各由图对比可知，原血血清的杂质峰较多，经过各种方法去除后只有经过乙腈处理后留下的杂质峰最少，适合于后续的血清中其他样品的检测。

3 结论

血浆样品前处理主要有蛋白沉淀法（PPT）、盐析法、加热法和液液萃取法（LLE）[3]。通过以上实验对比可知乙腈沉淀法去除血清中的杂质峰效果最好，干扰最小。为HPLC血清中的杂质峰的排除提供了一种最优化的方法。

[1]Dekker LJ,Bosman J,Burgers PC,et al.Depletion of highabundance proteins from serum by immunoaffinity chromatography:A MALDI-TOF-MS study[ J].Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,2007,847(1):65-69.

[2]刘磊.生物样品自动化在线固相萃取—高效液相色谱分析方法学研究[D].天津:南开大学,2013.

[3]徐贵丽.天然活性成份獐芽菜苦苷在大鼠体内的药代动力学研究[D].天津:天津大学,2012.

[4]黄婧,钱大玮,段金廒,等.银荷降脂方中5种活性成分大鼠体内药动学研究[A].中华中医药学会第七次中药分析学术交流会会议论文集[C].中华中医药学会,2014.

[5]王莉,张学兰,赵资堂,等.菟丝子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血浆的药动学特征比较[J].中成药,2014(2):401-404.

A kind of Suitable for HPLC to Remove Interference Peaks in Serum

Zhao Jing,Chen Cai-fa,Mu Jing-jing,Han Wei-lu,Zhu Cheng-lei,Sheng Rui
(School of Life Sciences,Jiangsu Normal University,Jiangsu Xuzhou 221116)

Objectives:By comparing and optimizing the preparation method of serum samples,a method for removing the interference peak in serum by HPLC was established.Methods:The interference peak was removed by salting out method,heating method,extraction method and organic solvent method.The removal efficiency of serum interference peak was analyzed by HPLC.Results:The acetonitrile precipitation method could remove most of the protein in the serum,leaving little impurity peak.The heating method,the extraction method and the organic solvent method could remove the impurity peaks in the serum,but the interference peak was more,does not apply to the detection of other substances in the serum HPLC.Conclusion:The acetonitrile precipitation method to remove impurities in the peak of the best results,the smallest interference.Providing an optimized method for the further elimination of impurity peaks inserumby HPLC.

HPLC;Serum;Impurity peak;Salting out Method;Organic solvent precipitation Method;Extraction Method;Heating Method

O657.72 文献标志码：A

2096-0387（2017）06-0053-03

赵静（1986—），女，河南邓州人，硕士在读，研究方向：生物化学与分子生物学。