菜籽饼固态发酵生产蛋白饲料的研究

王明洁，李进一，何 荣，章 铖，史冰清，杨竺红，袁 建

南京财经大学食品科学与工程学院 (南京 210023)

菜籽饼固态发酵生产蛋白饲料的研究

王明洁，李进一，何 荣，章 铖，史冰清，杨竺红，袁 建

南京财经大学食品科学与工程学院 (南京 210023)

在菜籽饼固态发酵生产菜籽肽小试研究的基础上，根据混菌固态发酵菜籽饼的中试发酵工艺，研究了发酵前后菜籽饼中抗营养因子硫甙、异硫氰酸酯(ITC)、恶唑烷硫酮(OZT)等含量的变化规律以及营养成分粗蛋白、水溶性蛋白、多肽等含量的变化规律。并且通过高效凝胶过滤色谱法与基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS/MS)对发酵菜籽多肽的相对分子质量和氨基酸序列的分析，这使得对发酵菜籽饼产品的营养价值有了更深刻的认识。

菜籽饼；固态发酵；蛋白

我国是一个传统的农业大国，油菜籽产量极高，而且其种植面积、油菜籽产量都位列世界第一。2016年我国油菜籽的播种面积达到710万hm2，单位产量为1.972 t/hm2，2016年我国油菜籽产量约为1 400万t。菜籽饼粕是一种重要的植物蛋白资源，菜籽饼粕所含营养成分主要包括多种维生素、碳水化合物、蛋白质、矿物质[1]，对于蛋白质饲料而言，是一种重要的蛋白补充资源，其粗蛋白含量一般在35%～40%。而且碳水化合物20%～25%，钙0.61%，磷0.95%，消化能10.46～12.55 kJ/kg。和豆粕对比而言，菜籽饼粕含有较高的蛋白质，而且还有丰富的氨基酸，但是菜籽饼粕除粗纤维外，还含有单宁、硫甙等抗营养因子，影响其作为饲料的营养物质利用率、安全性。

微生物发酵法可以有效降解硫甙等抗营养因子，将大分子菜籽蛋白酶解成低分子肽，并尽可能提升蛋白质的利用率[2]。微生物发酵法安全，高效，应用范围广，同时微生物固态发酵的环境要求不高，工艺流程容易实现，不会破坏营养物质[3]。本实验在菜籽饼固态发酵生产菜籽肽小试研究的基础上，确定30 L固态发酵罐的中试发酵工艺，并对发酵产品质量进行评价，比较发酵前后菜籽饼营养价值变化，为发酵饲料放大试验与应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：Bacillus subtilis 20030、Actinomucor elegans 40252 ,购于中国工业微生物菌种保藏中心；菜籽饼，粗蛋白质含量38.78%，水分10.24%，粗脂肪含量13.22%，硫甙含量50.39 μmol/g，购于南通如东县跃洋贸易商行；牛血清蛋白、细胞色素C(马心)、蛋白酶抑制剂、杆菌肽、谷胱甘肽(还原型)，北京索莱宝科技有限公司；乙腈，色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.2 培养基

枯草芽孢杆菌采用营养琼脂培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min，不加琼脂作液体培养基使用。

雅致放射毛霉采用PDA培养基培养。

发酵基础培养基：菜籽饼95%，麸皮5%，料液比1∶1.35，葡萄糖添加量0.5%，KH2PO4添加量0.36%。

1.3 仪器与设备

超净工作台，苏净集团安泰公司；隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂；全温立式振荡培养箱，太仓市实验设备厂；实验室粉碎磨(JFSD-70)，嘉定粮油检测仪器公司；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；冷冻离心机(Beckman Coulter J6)， Beckman Coulter公司；多功能酶标仪(SpectraMax M2e)，美国Molecular Devices公司；PQX型多段可编程培养箱，宁波东南仪器有限公司；Waters 2998高效液相色谱仪，waters公司；30 L固体发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1试验菌种及其种子液的制备

菌种活化：将原始菌株接种到斜面培养基上培养，备用。

一级种子液的制备：枯草芽孢杆菌：取一活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的三角瓶中，30 ℃，150 r/min培养24 h。

发酵种子液的制备：枯草芽孢杆菌：从上述培养好的一级种子液中，接取2 mL种子液(接种量为2%，v/v)到装量为100 mL种子培养基的三角瓶中，30 ℃，150 r/min培养24 h，制成发酵种子液。雅致放射毛霉：从试管斜面里取出毛霉，接于毛霉种子培养液里，30 ℃，150 r/min培养48 h，即成毛霉菌悬液。

1.4.2中试试验方法

中试发酵方法：参照混菌固态发酵生产菜籽肽的优化条件[4]，釆用雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌混菌。在30 L固态发酵罐内对发酵混合物进行蒸汽灭菌，间隔50 min对发酵混合物进行约1 min的正反搅拌，持续通入无菌空气以保证有氧环境，发酵温度保持在32.0 ℃，发酵一定时间后取样保存在零下4 ℃，以进行指标测定。发酵结束后，发酵产品进行干燥处理。

发酵混合物组成为：菜籽饼3 800 g、麸皮200 g，固液比1∶1.35，葡萄糖添加量为固液总质量的0.5%，KH2PO4添加量为固液总质量的0.36%，枯草芽孢杆菌接种量为600 mL，雅致放射毛霉接种量为150 mL(两菌接种体积比4∶1)，混匀。

1.4.3发酵基质的处理

取5.0 g发酵后的固态基质，加50mL蒸馏水，磁力搅拌30 min，4 ℃条件下6 000×g离心20 min，收集上清液。用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，除去不溶物和细菌，备用。

1.5 测定指标及方法

1.5.1硫甙含量的测定

硫甙含量的测定采用氯化钯法[5]。硫甙的降解率按以下公式计算：

(1)

1.5.2异硫氰酸酯(ITC)和恶唑烷硫酮(OZT)含量的测定

ITC采用硫脲比色法，NY/T 1596—2008。

OZT采用紫外分光光度法，NY/T 1799—2009。

计算公式如下：

(2)

(3)

1.5.3单宁含量的测定

单宁含量的测定，采用邻二氮菲-铁(Ⅲ)分光光度法测定[6]。

1.5.4植酸含量的测定

植酸含量的测定，采用三氯化铁比色法[7]。

1.5.5粗纤维含量的测定

粗纤维含量的测定，根据GB/T 6434—2006。

1.5.6粗蛋白和水溶性蛋白含量的测定

凯氏定氮法，GB/T 5511。其中，氮溶解指数(%)按以下公式计算：

(4)

1.5.7粗脂肪和灰分含量的测定

粗脂肪和灰分分别采用GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007测定。

1.5.8蛋白酶活力的测定

蛋白酶活力的测定采用福林法，GB/T 23527—2009。

其中，蛋白酶活力标准曲线为：

(5)

1.5.9多肽含量测定

根据鲁伟[8]，王雪峰[9]的蛋白水解液中多肽含量的测定方法。

其中，以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽作为标准品制作多肽标准曲线：

(6)

1.5.10菜籽多肽相对分子量分布的测定

高效凝胶过滤色谱法：采用Waters 2998高效液相色谱仪，测定菜籽多肽相对分子量分布。

色谱柱，TSK gel G2000SWXL，300 mm×7.8 mm；流动相，乙腈∶水=20∶80，并添加0.1%的三氟乙酸；流速0.5 mL/min；进样体积20 μL；检测波长220 nm；柱温：室温。

分子量校正曲线所用标准品：牛血清蛋白(Mw68000)、细胞色素C(Mw12384)、蛋白酶抑制剂(Mw6511.51)、杆菌肽(Mw1422)、还原型谷胱甘肽(Mw307)。以相对分子量的对数(lgMw)对洗脱体积作图得到分子校正曲线。

1.5.11发酵菜籽饼中多肽氨基酸序列分析

(1)色谱条件

色谱柱，TSK gel G2000SWXL，300 mm×7.8 mm；流动相，A：乙腈，B：水+0.1%甲酸；检测波长220 nm；流速0.4 mL/min；进样体积10 μL；柱温：室温；洗脱条件：等度洗脱45 min，20%A+80%B。

(2)质谱条件

破碎电压1.0 V；正离子模式；自动MS/MS(n)；质量扫描范围 100～2 000 M/Z。

将发酵处理液经0.22 μm滤膜过滤，进样，数据采集结束后，得到总离子流图，液相图，一级质谱图和二级质谱图，用PEAKS软件(Version 6.0)解析串联质谱数据。

1.6 数据处理

测试多个样品，数据以平均值±标准差表示。数据采用SPSS 22.0统计分析软件进行单因素方差分析(ANOVA)，平均值之间的差异由Duncan的多范围检验进行处理，显著性定义为p <0.05。图表由Graph Pad Prism 7绘制。

2 结果与讨论

2.1 菜籽饼中试发酵结果与分析

2.1.1发酵前后菜籽饼抗营养因子含量变化

菜籽饼抗营养因子含量随发酵天数变化结果见表1，发酵后菜籽饼抗营养因子除了单宁的含量由0.64%提高到1.48%外，其余抗营养因子的含量显著降低，其中硫甙的含量由50.39 μmol/g降低到32.61 μmol/g，硫甙降解率为35.28%；ITC与OZT的含量在发酵4 d后分别降低了42.01%与61.84%，第5 d起ITC与OZT的含量极低，仪器未检出；植酸与粗纤维分别下降了31.87%与15.53%。

如图1所示，随着发酵的进行，在2～3 d时硫甙被大量降解，而硫甙降解率在发酵第4 d后趋于稳定，表明发酵时间的延长并没有对硫甙降解率产生太大影响，与鞠兴荣等[10]小试研究结论相似。分析其原因可能是，在混菌发酵中，枯草芽孢杆菌是分泌芥子酶的主要微生物，在发酵前72 h，枯草芽孢杆菌快速繁殖，产生大量芥子酶系降解硫甙；在发酵后期，枯草芽孢杆菌进入衰亡期，菌落大量死亡，因此发酵5 d后硫甙降解率趋于稳定。

表1 发酵前后菜籽饼抗营养因子含量变化(干基)

注：数值以平均值±标准偏差的形式表示，不同的小写字母表示同一列中存在显著差异(p<0.05)。

图1 不同发酵时间对硫甙降解率和蛋白酶活的影响

随着发酵时间的延长，菜籽饼中单宁含量不断增加。 李丹等[11]在分析不同大豆原料中单宁含量差别时，同样发现与普通豆粕、膨化豆粕和膨化大豆相比，发酵豆粕中单宁含量最高。其原因可能是在发酵过程中，原本表面光滑，排列紧密，网状结构清晰的菜籽饼在微生物的作用下网状结构消失，粗糙，孔隙增多[12]，致使菜籽饼内单宁大量游离出来所以单宁含量不断增加。

2.1.2发酵前后菜籽饼营养物质含量变化

菜籽饼营养物质含量随发酵天数变化结果见表2，粗蛋白和水溶性蛋白含量分别由38.78%、2.89%增加到44.23%、18.72%；多肽含量在发酵6 d后增加到8.87%，提高了303.18%；粗脂肪的含量降低了35.4%。

表2 发酵前后菜籽饼营养物质含量变化(干基)%

枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉是中性蛋白酶的重要生产菌，利用这两种菌固态发酵菜籽饼，不仅可以降解抗营养因子，而且可以增加多肽的含量。经研究表明，在三角瓶小试阶段，随着发酵时间的延长，肽得率不断增加，在发酵第4～5 d，多肽含量达到最大值并趋于稳定。

本研究发现，在发酵罐中试阶段，如图2所示，肽得率和氮溶解指数在发酵5 d后仍显著上升，在第8 d达到最大值并趋于稳定。由图2可知，在发酵第7 d时蛋白酶活力才达到最大。分析其原因有以下两方面，一是在中试阶段，随着发酵菜籽饼的量大大增加，枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉与菜籽饼接触不充分，其胞外蛋白酶与菜籽饼的作用时间将延长；二是枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉生长周期不同步，在发酵第5 d，枯草芽孢杆菌进入衰亡期，而此时雅致放射毛霉仍然生长旺盛，产酶量较多，因此蛋白酶活性在发酵第5 d后依然增加。但是，在发酵6 d后，发酵菜籽饼出现较为强烈的氨味。因此，在发酵罐中试阶段，混菌发酵菜籽饼的最佳时间为5～6 d。

图2 不同发酵时间对发酵指标的影响

2.2 混菌发酵处理液中菜籽蛋白肽的分子量分布

2.2.1标准曲线的绘制

得到标准品凝胶过滤色谱图，如图3所示。

图3 混合标准物质凝胶过滤色谱图

峰号标准品洗脱体积/mL相对分子质量相对分子质量对数/lgM1牛血清蛋白11．468680004．8332细胞色素C12．257123844．0933抑肽酶14．5326511．513．8144杆菌肽17．19814223．1535还原型谷胱甘肽20．3163072．487

表3是各标准品的洗脱体积、相对分子质量和相对分子质量对数的对应关系。以相对分子量的对数(lgMw)对洗脱体积V做线性回归，得到线性回归方程：lgMw=-0.239 94V+7.311 87，R2=0.951 77。

2.2.2发酵前后菜籽蛋白肽的分子量分布结果分析

动物对蛋白质及氨基酸的消化利用率是评判饲料蛋白质品质的主要标准。经过固态发酵微生物可以将大分子菜籽蛋白分解为小分子多肽，多肽易于被消化道吸收且具有调节生理功能、增强免疫力、促进氨基酸吸收等作用，而其生理活性取决于多肽分子量大小及氨基酸序列。

发酵前菜籽蛋白肽的洗脱曲线如图4，发酵第1 d、3 d和5 d发酵处理液中菜籽蛋白多肽的洗脱曲线如图5，使用GPC软件对色谱图处理得到发酵前后多肽的分子量分布，结果见表4。

图4 发酵前菜籽蛋白肽的分子量分布

图5 发酵处理液中菜籽蛋白肽的分子量分布

发酵前菜籽多肽含量很少，多肽的相对分子质量主要分布在1 000 Da以下，相对分子质量在500～1 000 Da范围的含量约为9.14%，相对分子质量比较集中在500 Da以下，含量约为60%，还有约20%的组分为游离氨基酸以及具有有不饱和双键结构的杂质。枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉混菌固态发酵菜籽饼，产生胞外中性蛋白酶，将大分子蛋白质分子逐渐酶解为多肽，并进一步裂解为小分子多肽和氨基酸残基。发酵第5 d时，发酵处理液中菜籽多肽相对分子质量在5 000～10 000 Da的组分含量约为8.38%，寡肽含量比较丰富，约占重量的75%，其中相对分子质量在1 000 Da左右的组分约为26.45%，相对分子质量在100～500 Da组分约为26.16%。将图5发酵第1 d、第3 d与第5 d进行比较，可以看出，随着发酵时间的延长，发酵处理液中多肽含量增加并且小分子多肽含量占比逐渐增大。

表4 发酵前后多肽的分子量分布

3.2.3发酵菜籽肽二级质谱分析

图6 发酵菜籽肽二级质谱图

如图6(a)，M/Z的值为57.0，与分子量为75的G脱去一分子水相等，则M/Z的值为57.0的峰应该是分子量为75的G；而M/Z的值为106.0的峰应该是分子量为105的S与H+结合的正离子，则M/Z值为161.0的峰的氨基酸序列应该是：-G-S-。

由图6(b)可以推断，M/Z的值为101.0，而分子量为120的T脱去一分子水为102.0，与101.0接近，则M/Z的值为101.0的峰应该是分子量为120的T；M/Z的值为56.9的峰与分子量为57的G接近，则M/Z值为159的峰的氨基酸序列应该是：-T-G-。

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的活性三肽，具有清除自由基、延缓衰老、抵御细胞脂质过氧化等生理功能，是一种天然的抗氧化肽[13]。章邵兵等[14]利用电喷雾质谱测得一个菜籽抗氧化肽的结构为T-P-L-T-G，其中活性最高的抗氧化肽的N端残基为Tyr。因此，分析得出的-Gly-Ser-和-Thr-Gly-片段可能是菜籽抗氧化肽的残基，也验证了菜籽肽具有抗氧化性[15]。

3 结论

根据混菌固态发酵菜籽饼的中试发酵工艺，研究发现菜籽饼发酵前后抗营养因子除了单宁的含量提高外，硫甙、异硫氰酸酯(ITC)、恶唑烷硫酮(OZT)、植酸、粗纤维等抗营养因子的含量显著降低。营养因子粗蛋白和水溶性蛋白含量增加；粗脂肪的含量降低了；多肽含量显著增加在第8天达到最大值。并且通过质谱分析表明发酵菜籽肽的相对分子质量大小范围在1000Da以下；并且发酵菜籽饼中含有大量如-G-S-、-T-G-等的二肽，这使得对发酵菜籽饼产品的营养价值有了更深刻的认识。

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Studyofproteinfeedbysolid-statefermentationofrapeseedcake

Wang Mingjie, Li Jinyi, He Rong, Zhang Cheng, Shi Bingqing, Yang Zhuhong, Yuan Jian

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance & Economics (Nanjing 210023)

Based on the small-scale study on the production of rapeseed peptides by solid-state fermentation of rapeseed cake, according to the fermentation technology of fermented rapeseed cake, the changes of anti-nutritional factors such as glucosinolate, isothiocyanate (ITC) and oxazolidine thione (OZT) in rapeseed cake before and after fermentation were studied. In addition, the changes of crude protein, water-soluble protein, peptides and other changes were studied. The relative molecular mass and amino acid sequence of the rapeseed peptides were analyzed by high performance gel filtration chromatography and MALDI-TOF/TOF-MS/MS, which makes it a deeper understanding of the moment on the nutritive value of fermented rapeseed cake products.

rapeseed cake; pilot scale fermentation; protein

2017-09-30

南京市农业科技攻关计划项目(201505056)，六大人才高峰资助项目(NY-060)。

王明洁，女，1963年出生，副教授，主要研究方向农产品加工与贮藏。

TS201

A

1672-5026(2017)06-078-07