清肠利肝方对D-氨基半乳糖/脂多糖所致急性肝衰竭小鼠的防护作用*

张向颖 勾春燕 李 丽 李红艳 任 锋 李秀惠△

1.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合中心 (北京 100069) 2.北京市肝病研究所

·实验研究·

清肠利肝方对D-氨基半乳糖/脂多糖所致急性肝衰竭小鼠的防护作用*

张向颖1,2勾春燕1李 丽1李红艳1任 锋2李秀惠1△

1.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合中心 (北京 100069) 2.北京市肝病研究所

目的探讨中药组方清肠利肝方对D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)所致急性肝衰竭小鼠的防护作用并探究其相关机制。方法将野生型健康C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、急性肝衰竭模型组(简称模型组)和清肠利肝方干预组(简称干预组)。模型组和干预组小鼠腹腔注射D-GalN(700 mg/kg) /LPS (10 μg/kg)诱导肝衰竭；干预组小鼠注射D-GalN/LPS前3天以清肠利肝方灌胃，1次/d。D-Gal/LPS给药6小时后收集小鼠肝脏组织和血清。观察各组小鼠肝脏损伤变化及相关炎症分子的变化情况。结果模型组小鼠肝脏损伤严重，大片肝组织充血坏死；干预组小鼠肝脏损伤较模型组减轻，促炎因子水平低于模型组，MAPK通路炎症相关蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论清肠利肝方对D-GalN/LPS所致小鼠急性肝衰竭有明显防护作用，其机制可能与调节MAPK通路而发挥抗炎作用有关。

清肠利肝方；急性肝衰竭；炎症

急性肝衰竭(ALF)是由炎症介导的肝细胞损伤，并伴随肝细胞凋亡和坏死的临床综合症[1]，多由肝炎病毒、应用肝毒性药物或肝脏缺血再灌注损伤等病因引起。在临床上多表现为病情危重、发展迅速、病死率很高。由于其确切发病机制并不明确，迄今在临床上除肝移植外尚没有特异有效的治疗药物和方法[2]。中西医结合的方法在临床治疗肝衰竭过程中发挥了重要作用。清肠利肝方是我院协定处方，应用临床10多年，取得了较好的临床效果，但具体相关机制尚不明确。本研究通过建立D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭小鼠模型，探讨清肠利肝方的保肝作用及相关机制，为后续研究和推广该方奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 健康C57BL/6雄性小鼠，8～12周龄，重量18～25g，购自军事医学科学院，在北京市肝病研究所饲养，实验前12h和实验期间禁食，自由饮水。D-氨基半乳糖(D-GalN，700 mg/kg)，脂多糖(LPS，10 μg/kg)购自Sigma公司。p-JNK、p-ERK、p-p38和β-actin兔抗鼠单克隆抗体以及辣根过氧化酶(HRP)偶联的羊抗兔多克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司；增强化学发光试剂盒购自美国Santa Cruz公司；蛋白定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司。SuperScript Ⅲ Platinum Two-step qRT-PCR试剂盒和Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司。Luminex检测系列细胞因子试剂盒为美国Affymetrix eBioscience 产品。清肠利肝方所用药物购自北京康仁堂药业，方剂组成：生地、大黄、厚朴、蒲公英、枳壳，为水煎剂。

1.2 实验方法 实验分组：将30只野生型健康C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、急性肝衰竭模型组(简称模型组)、清肠利肝方干预组(简称干预组)，每组10只。模型组和干预组小鼠采用腹腔注射D-GalN(700 mg/kg)和LPS(10μg/kg)，均注射1次，建立急性肝衰竭模型，干预组小鼠在造模前3天灌胃清肠利肝方汤剂，剂量为0.05ml/每克体重,正常组和模型组小鼠以等量生理盐水灌胃均1次/d。造模后6h开始收集小鼠肝组织和血清。

1.3 观察指标 ①肝组织病理检测： 小鼠肝组织以10%甲醛溶液固定24h以上，石蜡包埋，制备5μm组织切片，进行HE染色，光学显微镜下观察组织损伤情况。②炎症相关基因实时荧光定量PCR检测：用Trizol试剂提取肝组织总RNA，操作按说明书进行，测定总RNA浓度；用qRT-PCR试剂盒合成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR检测，具体操作按试剂盒说明书进行。③细胞因子水平测定： 采用luminex液相芯片系统测定炎症因子包括TNF-α、IL-10、CXCL-10、IL-12水平。④组织蛋白提取、浓度测定以及蛋白免疫印迹检测：用加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液匀浆肝组织提取蛋白，离心力为8000g，4℃离心5min；取上清液进行蛋白浓度测定；蛋白免疫印迹操作如下：取蛋白样品电泳、蛋白转膜、第一抗体(1∶1000稀释)孵育，TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔第二抗体孵育(1∶2000稀释)，TBST漂洗后取等量的ECL发光试剂A液和B液混匀后孵育PVDF膜，压片曝光。

2 结果

2.1 3组小鼠肝脏病理检测结果 见插页图1。

正常组小鼠肝组织表面光滑，边缘整齐，组织切片显示肝细胞形态结构完整，未见变性坏死等；模型组小鼠肝组织呈弥漫性炎症坏死出血，坏死面积近2/3，汇管区结构改变，肝细胞水肿变性，广泛坏死，炎性细胞浸润；干预组小鼠肝脏较模型组病变明显减轻，未出现融合性大块坏死，肝组织结构基本正常，炎性细胞浸润较少。

2.2 3组小鼠肝组织中炎症因子基因水平检测结果 见图2。

图2 3组小鼠炎症因子基因水平检测结果

与模型组小鼠相比，干预组小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趋化因子基因水平均降低，而炎症抑制因子IL-10基因水平上升(P<0.01)。

2.3 3组小鼠血清炎症因子水平检测结果 见图3。

图3 3组小鼠血浆炎症因子检测结果

与正常组相比，模型组小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趋化因子水平上升；与模型组相比，干预组小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趋化因子水平均降低，而炎症抑制因子IL-10水平上升(P<0.0001)。

2.4 3组小鼠肝组织炎症相关蛋白免疫印迹结果 见图4。

图4 3组小鼠肝组织炎症相关蛋白免疫印迹图

与正常组相比，模型组小鼠肝组织中磷酸化的JNK、ERK、和p38蛋白表达增加；干预组小鼠JNK、ERK、和p38蛋白表达降低。

3 讨论

全球约有3.5亿人为HBV慢性感染者，而中国有近1亿人为慢性HBV感染者，其中有15%至40%未经抗病毒治疗的患者将进展为终末期肝病，如肝硬化、肝衰竭及肝癌等[1～3]，其中仅单一HBV感染性肝衰竭占肝衰竭总数的82.2%[4]。因此，我们制备了D-GalN/LPS诱导建立急性肝衰竭模型，以清肠利干方进行干预，以深入探讨其作用机制。

肝衰竭属中医“急黄”、“瘟黄”范畴，毒、瘀、虚是肝衰竭的主要病机， 在中医肝病名家钱英教授“截断逆挽”思想指导下，中西医结合中心李秀惠教授在小承气汤基础上创立了以解毒、活血、益气为组方原则的“清肠利肝方”治疗肝衰竭。10余年来的临床应用证明了其治疗肝衰竭的有效性，该方口服或灌肠给药，可显著改善乙型肝炎肝衰竭患者腹胀、乏力症状，保护肝肾功能，防止肝性脑病、自发性腹膜炎等并发症，降低病死率[5，6]。清肠利肝方作为我院协定处方在临床上获得了广泛应用，但进一步推广需要提供现代医学基础研究证实的明确作用机制。

本研究结果说明清肠利肝方具有明显地防护肝脏损伤的作用。为进一步探讨清肠利肝方可能的作用机制。我们对模型动物的炎症因子水平进行了研究。促分裂素原活化蛋白激酶(MAP激酶),MAPK链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用，其中ERK信号转导通路调控细胞生长和分化，JNK和p38 MAPK信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。观察发现：模型组小鼠中，MAPK通路上磷酸化的JNK、ERK、p38水平均增加，且同时伴有TNF-α、IL-12、CXCL-10因子水平的升高，而在清肠利肝方干预后，上述MAPK通路炎症相关蛋白磷酸化水平下降，伴随相关炎症因子的水平降低。这提示清肠利肝方可能通过调节MAPK通路上相关蛋白的磷酸化水平来发挥其抗炎作用。

[1] European association for the study of the liver. EASL clinical practice guidelines: management of chronic hepatitis B [J]. J Hepatol, 2009,50(2):227-242.

[2] Liu Y,Wang CM ,Cheng J,etal. Hepatitis B virus in tenofovir-na?ve Chinese patients with chronic hepatitis B contains no mutation of rtA194T conferring a reduced tenofovir susceptibility[J]. Chin Med J, 2009,122(13):1585-1586.

[3] 中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组.肝衰竭诊治指南[J].中华肝脏病杂志, 2012,21(3):177-183.

[4] 刘晓燕，胡瑾华，王慧芬，等.1977例急性、亚急性、慢加急性肝衰竭患者的病因与转归分析[J]. 中华肝脏病杂志,2008,16(10):772-775.

[5] 胡建华，李秀惠. 清肝利肠方结肠透析治疗慢性乙型重型肝炎的临床研究[J].北京中医药，2010, 29(6)：403-406.

[6] 来要良，李秀惠，钱英. 清肠养肝方灌肠治疗慢性重型乙型肝炎临床观察[J].中西医结合肝病杂志，2007,17(2)：71-72.

PreventiveeffectsofQingchangliganformulaonacuteliverfailureinmiceinducedbyD-galactosamineandlipopolysaccharide

ZHANGXiang-ying1,2,GOUChun-yan1,LILi1,LIXiu-hui1△,etal. 1.CenterforintegratedtraditionalChineseandWesternmedicine,BeijingAdventistHospital,CapitalMedicalUniversity(Beijing, 100069 )China

Objective:To investigate the protective effects of the Qingchangligan formula against acute liver failure caused by D-Gal-LPS in mice.MethodsAcute liver failure (ALF) was induced by intraperitoneal injection of D-GalN (700 mg/kg) plus LPS (10 μg/kg). The Qingchangligan formula was administered to mice in three doses of 50 mg/kg (on day 1, day 2, and day 3) prior to D-GalN/LPS injection by intragastric administration. The mice in different groups were sacrificed at 6 h after D-GalN/LPS injection, and liver samples and blood were collected for analysis.ResultsIn the model group, the mice had serious liver injury and liver necrosis. Compared with model group, pretreatment with the Qingchangligan formula reduced the expression of inflammatory cytokines by decreasing the expression of components of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway.ConclusionQingchangligan formula exerts a protective effect against the pathophysiology of ALF, especially in regulating liver inflammation.

Qingchangligan formula; acute liver failure; inflammation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.011

国家自然科学基金(No.81473500),北京市自然科学基金(No.7132105);△通迅作者

2017-02-22 编辑：韦 怡)