一氧化氮在结直肠癌中的研究进展

姚晓宇 综述，刘风玲审阅

河北医科大学第四医院肿瘤内科，石家庄050000

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是目前常见的消化道恶性肿瘤之一。据2017年公布的数据表明，结直肠癌的发病率和病死率均居所有肿瘤的第3位[1]。CRC发生发展的危险因素包括散发性CRC家族史、发病年龄较早、缺乏体力活动、饮食改变、久坐的生活方式以及肿瘤发生前的慢性炎症等。其中，炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn disease，CD）被认为是结直肠癌发生发展的高危因素[2]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是神经元释放的血管活性因子，也可由胃肠、脑、心、肝、肾等脏器的组织细胞产生，可以松弛血管平滑肌抑制其细胞增殖，改善血管紧张度，调节血流，抑制血小板的聚集和白细胞的激活，达到舒张血管的作用[3]。有研究证实，NO作为一种炎性介质，在肿瘤的转移和复发过程中发挥重要作用[4]。其可能的作用机制包括DNA直接损伤、DNA合成抑制以及抑制限速酶核糖核苷酸还原酶[5]。本文将总结NO作为结直肠肿瘤标志物的相关研究进展，以期为结直肠癌的诊断、治疗提供新思路。

1 NO与炎症

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子如病原体、受损细胞或其他有害刺激物所发生的防御反应，并且是涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性应答。Hofseth和Ying[6]通过研究证实慢性炎症引起活化的炎性介质产生，可释放活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、溶解酶和细胞因子，这些炎性介质通过破坏DNA或邻近的上皮细胞和基质细胞来加剧炎性反应。慢性炎症还可以促进DNA合成和细胞增殖，破坏DNA修复途径和细胞微环境，抑制细胞凋亡，并通过免疫抑制促进血管生成[7]。最重要的是，慢性炎症在分子水平上产生自由基和醛类发挥重要作用，该过程同时伴有有害的基因突变，肿瘤相关关键蛋白和炎性代谢物包括细胞因子、生长因子和核转录因子（nuclear factorkappa B，NF-κB）的翻译后修饰，控制癌基因（抑癌基因和致癌基因）的表达和炎症关键酶[即诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）]的改变。

文献证据表明，与CRC有关的炎性介质包括NF-κB、Toll样受体、ROS、RNS、COX、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、促炎和抗炎细胞因子、抗氧化酶、激酶、生长因子、肿瘤抑制蛋白p53、视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）等[6]。NO是CRC发病机制中的重要生物标志物之一，其在调节从结直肠腺瘤到结直肠癌和转移癌的发展过程中起关键作用[8]。Cross和Wilson[9]研究证实，iNOS表达的增加与抑制NO的产生导致CRC的改善。炎症促进NO产生的分子机制包括氧化性DNA损伤，基因突变以及炎性介质如细胞因子、趋化因子、生长因子、缺氧诱导型干扰素-α、NF-κB和肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等的生成增多，诱导iNOS，可导致肿瘤的发生和进展[10]。另外，NO可以为浸润肿瘤微环境的细胞提供生物活性分子，通过促进上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和促进其他致癌途径如基因组不稳定性、能量代谢重编程和免疫逃逸的发生来增加结直肠癌的发病风险。

2 NO与细胞凋亡

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，是一种进化上保守的细胞自我破坏的过程，在生物的发生、分化以及稳态平衡中具有重要的作用[11]。细胞凋亡的机制极为复杂，除了涉及如凋亡因子、受体、适配蛋白、启动蛋白、效应蛋白、抑制蛋白等多种蛋白的相互作用外，还涉及线粒体和内质网（endoplasmic reticulum，ER）。Mori[12]报道，NO引起ER应激，诱导转录因子CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer binding proteins homologous protein，CAAT/CHOP）表达，并导致细胞凋亡。肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。Kuschak等[13]的研究表明，COX-2在肠上皮细胞中的过表达导致其表型改变，其可能通过改变乙酰氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9）、乙酰氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）的活性来激活不同的分子通路如 p53、Fas、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和激活凋亡细胞表面特定的感应器即死亡受体，将DNA降解为核小体片段，来发挥其诱导细胞凋亡的作用，从而增强CRC肿瘤细胞增殖或转移的能力。Brüne等[14]报道了NO促凋亡途径与复杂的信号通路并存，其通过线粒体依赖途径、抑癌基因p53的参与、细胞保护蛋白的表达以及S-亚硝基化阻断半胱氨酸蛋白酶的表达来促进细胞凋亡。另外，也有研究证实了NO在增加Fas表达中的作用，而Fas表达的增加也可以诱导细胞凋亡[15]。细胞色素C从线粒体释放至细胞质是诱发细胞凋亡的关键步骤。关于细胞色素C释放促进细胞凋亡的具体机制，目前有一种假说是B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白形成通道，调控细胞色素C释放。Yazbeck等[16]证实NO可以通过释放细胞色素C和线粒体中的其他因子产生环磷 酸 鸟 苷（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP），从而影响Bcl-2蛋白家族的许多成员包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达。NO作为促凋亡调节剂，将线粒体中的细胞色素C释放入细胞质中，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，上调p53以及凋亡相关蛋白（包括Bcl-2家族）的表达。Mori[12]证实过量的NO引起细胞凋亡，而低浓度的NO可以保护细胞免于凋亡。低浓度的NO可以通过抑制线粒体细胞色素C释放、神经酰胺产生和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化来发挥抗凋亡作用，其抗凋亡机制可分为cGMP依赖性机制和非cGMP依赖性机制两种[15]。在一项实验研究中，Park等[17]证实通过NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（S-Nitroso-N-acetylpenicillamine，SNAP）或转染神经元NOS产生的NO，通过抑制线粒体细胞色素C的释放、caspase 3和caspase 9的激活以及DNA的片段化，促进6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamin，6-OHDA）诱导的PC12细胞凋亡。Snyder等[18]证实NO能够抑制线粒体电子传递链，导致超氧化物的产生和过氧化亚硝酸盐形成的增加，同时清除ROS或过亚硝酸盐。

3 NO与血管生成

肿瘤生长具有明确的血管依赖性，肿瘤通过新生血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力[19]。可见，血管生成在肿瘤进展和转移过程中发挥重要作用。已有研究证实，NO通过调节各种基因和转录因子使平滑肌细胞产生cGMP，同时抑制血管收缩肽内皮素-1和去甲肾上腺素从交感神经末端释放，通过血管张力（舒张血管）、血管重塑（抑制平滑肌细胞增殖）和血管细胞间相互作用（抑制血小板黏附和聚集、抑制单核细胞黏附）等各种机制达到促进血管调节的目的。Bing等[20]证实，血管内皮生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和类花生酸物质（eicosanoids）可以调节血管生成，而成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）在血管生成的早期阶段及异常血管表型的诱导中起主要作用。NO介导许多血管生成因子的功能，如VEGF、1-磷酸鞘氨醇、血管生成素、雌激素，通过与磷脂酶钙调蛋白结合和磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）磷酸化激活内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）[21]。NO可刺激表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路以及抑癌基因p53和VEGF，这些介质是通过内皮细胞中CD93蛋白表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）样域上调eNOS而加剧血管生成的。NO的不断生成可以选择在突变型p53细胞中进行，并通过上调VEGF来促进肿瘤血管生成。此外，NO可通过EGFR/PI3K信号转导通路上调p53、PARP和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）来调控肿瘤DNA的修复机制。iNOS通过激活受体酪氨酸激酶和蛋白激酶C信号转导途径，上调VEGF表达，调控微血管密度、肿瘤血管生成，及肿瘤的侵袭、生长和进展，在诱导血管和淋巴管生成中发挥巨大作用。iNOS上调导致NO表达也在增加，伴随调节血管的COX-2、血管生成素样蛋白（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）的表达以及整联蛋白/JAK/STAT3途径的通透性增加。COX-2通路和5-脂加氧酶（5-lipoxygenase，5-LOX）通路可能代表一种整合系统，COX-2/5-LOX从正常黏膜、腺瘤到结肠癌的表达具有递增趋势，COX-2/5-LOX参与了结直肠癌的形成过程，并在从结肠腺瘤进展至结肠癌的发展过程中起到了一定的促进作用，且参与了结直肠癌肿瘤细胞的浸润及转移等恶性生物学行为[22-23]。Tavolari等[24]证实了5-LOX及其产物，特别是白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）在结直肠癌的发生和进展中发挥巨大作用，而COX-2的出现使5-LOX的表达和活性在结肠癌肿瘤大小、浸润深度和血管浸润组织的发生发展过程中出现上调。另有一项结肠癌细胞的实验研究表明，使用COX-2/5-LOX抑制剂后，可使COX-2/5-LOX mRNA、蛋白及下游产物PGE2/LTB4的表达减少，当单一使用较高的COX-2抑制剂后，可增加5-LOX分流，减弱COX-2抑制对细胞增殖的负性影响[25]。

4 NO与结CRC

在结肠癌的发病机制中，“结肠腺瘤到结肠癌”的序列进展过程被人们公认[26-27]。其中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢通路在结直肠癌的形成与发展中起着重要作用[23]。未酯化的花生酸主要有两类重要的酶代谢：环氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂加氧酶（lipoxygenase，LOX）。Janakiram和Rao[28]发现COX和LOX途径及持续存在的炎性细胞参与促炎性脂质介质和基因反应，产生有利的肿瘤微环境，最终导致肿瘤细胞生长、增殖和转移。其中，NO可以通过为浸润肿瘤微环境的细胞提供生物活性分子来增加CRC发病风险，细胞外基质修饰酶如基质金属蛋白酶就是这类生物活性分子中的一种，它的作用是促进EMT和促进其他致癌途径如基因组不稳定性、能量代谢重编程和免疫逃逸的发生。COX-2也可作为一种独立危险因素增加CRC的发病风险。COX-2过氧化物酶活性实际可以将许多物质最终转化为致癌物质，进而能够激活许多参与细胞增殖的基因。Ihara等[29]通过研究证实NO在调节COX-2的表达和活性进而促进结直肠癌转移的过程中发挥着重要作用。COX2也是前列腺素合成的诱导型介质，其代谢产物前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）也可增加CRC肿瘤细胞的增殖活性和转移潜能，促进肿瘤血管生成，诱导局部免疫抑制，抑制肿瘤细胞凋亡。

NO促进CRC发生和转移的作用可能涉及的机制还包括直接的DNA和蛋白质损伤或抑制程序性细胞死亡，从而促进细胞异常增殖。NO可以通过VEGF-C的参与而上调基质金属蛋白酶-2（matrix matalloproteinases-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（matrix matalloproteinases-9，MMP-9）以及下调基质金属蛋白酶抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）和基质金属蛋白酶抑制因子-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）的表达，从而在促进淋巴管生成和扩散到淋巴结中起到重要作用[30]。在CRC淋巴结转移的过程中，正常上皮细胞通过EMT转化为间充质细胞[31]。NO还会损害MMP的调节，这对控制基质重塑和转移至关重要[32]。NO还可以促进DNA损伤并抑制DNA修复机制，从而发生DNA链断裂和DNA突变引起遗传毒性效应。在临床上，杨钢等[33]通过检测CRC患者治疗前后NO水平变化发现，血清中TNF-α、NO、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）浓度与CRC密切相关，对TNF-α、NO、IL-1β、IL-6浓度进行联合诊断可作为CRC早期诊断的参考指标。田雅军等[34]通过研究发现，与健康体检人群相比，CRC患者血清中NO高表达，表明其与CRC的发生、发展密切相关，NO检测可作为判断CRC发生、分期及复发的参考指标。

既往研究结果证实，NO对于CRC的发生发展具有促进作用。彭金娥和潘敬新[35]则指出，机体中低浓度的NO促进肿瘤内部血管内皮细胞的增殖、迁移及血管重建以形成新生血管，增加血管通透性和肿瘤内血流量，在维持肿瘤生长及转移中起着重要作用，但是NO浓度升高不仅能直接杀伤肿瘤细胞，而且还能通过活化巨噬细胞从而发挥抗肿瘤效应。

5 小结

CRC是全球发病率较高的疾病之一。NO在CRC发生、发展中的作用尚不明确。一方面，已有研究表明，慢性炎症是CRC发生发展的高危因素，在各种炎性介质及细胞因子的作用下，NO通过为浸润肿瘤微环境的细胞提供生物活性分子、抗细胞凋亡和促进肿瘤血管生成来增加CRC发病风险。NO在调节COX-2的表达和活性进而促进CRC转移的过程中也发挥着重要作用。另一方面，NO通过许多上游信号和具有遗传改变的下游效应因子之间的串扰诱导细胞凋亡来发挥其抑癌作用。通过对NO的研究，有可能为CRC的产生以及预后作用提供有益帮助。