从长链非编码RNA角度探讨针灸治疗IBD的效应及调节机制

顾沐恩 吴焕淦 刘雅楠 张琳珊 刘慧荣 赵继梦 李晨 李璟

摘要 炎症性肠病（IBD）是病因和发病机制尚不明确的慢性炎症性疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。针灸在治疗IBD上具有显著的疗效和优势，但其作用机制需深入研究和探讨。近年来研究发现lncRNAs广泛参与机体的生理病理过程，尤其是可通过基因调控介导机体的免疫炎性反应，与包括IBD在内的多种免疫性疾病都有密切关系。IBD发生时有多种差异表达的lncRNAs，其表达和功能的异常可在IBD炎症的发生发展中有重要作用。文章就lncRNA的功能及与IBD关系的研究进展进行了总结，并基于针灸对IBD的治疗作用，以期研究针灸能否通过调控相关lncRNA起到对IBD炎性反应的调节作用，从而为针灸治疗IBD的机制研究提供新的思路。

关键词 IBD；中医针灸；长链非编码RNA；疗效机制；思考与展望

Abstract Inflammatory bowel disease （IBD），including crohn′s disease and ulcerative colitisis，are chronic inflammatory diseases with unclear etiology and pathogenesis.The effect of acupuncture and moxibustion on the treatment of IBD is curative and has significant advantages，but its mechanisms still need to be further studied.Studies in recent years found that lncRNAs widely involved in the physiological and pathological process of the body，especially mediating the immune inflammatory response through gene regulation，and have close relationship with variety autoimmune diseases that including IBD.A variety of lncRNAs differently expressed when IBD occurs，and the abnormal expression and function of lncRNAs play an important role in the development of IBD inflammation.In this article，the functions of lncRNA as well as research progress of its relationship with IBD are summarized，and then base on the treatment of acupuncture and moxibustion on IBD，we in order to study whether acupuncture and moxibustion regulate the inflammatory response of IBD through regulating related lncRNAs，which will provide new ideas for the research on the mechanism of acupuncture and moxibustion on the treatment of IBD.

Key Words Inflammatory bowel disease （IBD）； Acupuncture and moxibustion； Long non-coding RNA； Effective mechanism； Thought and prospect

中图分类号：R245.3；R259文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.046

长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类从基因组上转录而来的不编码蛋白质的长链RNA，在染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程中有重要作用。炎症性肠病（Inflammatory Bowel Diseases，IBD），包括克罗恩病（Crohn′s Disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC），是非特异性慢性肠道炎症性疾病，临床上主要表现为腹泻、腹痛，可有黏液或脓血便。其病因和发病机制十分复杂，肠道黏膜免疫异常反应所导致的炎性反应在IBD发病中起重要作用。随着现代生命科学研究的发展，基因组学研究发现基因的多态性和表观遗传调控与IBD的发生发展有着密切关系[1-2]。肠上皮黏膜屏障受损导致的肠道免疫失衡是引起IBD肠道炎症的关键因素，而lncRNA可调控相关的炎性反应基因以及炎性反应信号通路关键分子的转录，参与肠道炎症的发生发展。目前，针灸可通过影响多靶点和疾病过程的多个环节，在治疗IBD及免疫炎症调节上具有一定的作用，但其作用机制尚未完全阐明。因此，我们通过筛选与比较IBD的差异表达lncRNAs，阐释lncRNA在针灸治疗IBD的免疫调节机制。

1 lncRNAs与中医针灸

长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）转录本长度200 nt～100 kb，可由RNA聚合酶转录产生，主要位于细胞核内。lncRNAs根据其基因组位置的不同分为正义lncRNAs、反义lncRNAs、双向lncRNAs、内含子lncRNAs以及基因间lncRNAs[3]。lncRNAs序列保守性较低，曾认为lncRNAs是基因组转录过程中的垃圾副产物。晚近研究表明并非所有的lncRNAs都是转录噪声，其部分参与调控细胞周期、细胞分化等生理过程，在表观遗传修饰、转录水平、转录后加工及翻译水平等多个层面调控基因表达[4-5]。此外，lncRNAs具有不同的分子功能原型，包括信号传导、诱导、指引和支架等，这些lncRNAs功能原型可以为lncRNA如何捕获有用的蛋白作为生物传感器提供思路，并可暗示它们可能的起源[6]。lncRNA曾被普遍认为不能编码任何蛋白质，然而一些特异的lncRNAs可编码大量的微肽。在分析肌肉特异性的lncRNAs的功能时，发现了一种在骨骼肌中特异性表达的lncRNA，这一RNA以往被归类为非编码RNA，但它的序列中包含的一小段卻类似一个编码区域，并编码了一个包含46个氨基酸的微肽，称之为myoregulin（MLN）[7]。MLN形成了在结构上与表达于心肌和慢收缩骨骼肌中的小蛋白phospholamban（PLN）和sarcolipin（SLN）相似的一种跨膜α-螺旋。未来可能会发现有更多的lncRNA能编码小分子微肽。

lncRNA的生物功能被探索与研究，发现其功能和基因表达与临床疾病的表型密切关系，在孟德尔疾病、癌症、心血管疾病、神经系统疾病、炎症性肠病等疾病的发生发展中具有重要作用[8-9]。目前研究提示与lncRNAs相关的疾病约166种[10]。全基因组关联性研究（Genome-wide Association Studies，GWASs）发现，人类基因组中有大量与疾病表型相关的单核苷酸多态性（Genome-wide Association Studies，SNPs），其中217种与疾病的表型相关的SNPs位于162个lncRNAs位点，并与112种疾病表型相关聯，提示lncRNAs与疾病的发生关系密切[11]。

LncRNA、miRNA和mRNA之间构成复杂的网络，相互促进或抑制，也可形成复合物调节，在系统生物学中具有重要的作用，参与诸多的生物学功能。正常的机体功能是人体的基因有序表达的结果，机体的复杂系统会通过不同网络之间的信息传递和整合，使基因或其转录翻译产物蛋白质产生出最终的生物学功能，而机体的病或证则源于mRNA表达的失衡[12]。中医的整体观念运用阴阳五行学说解释生理、病理现象，将阴阳的对立统一看成普遍存在的规律，强调阴阳的平衡，脏腑功能趋于调和。非编码RNA与mRNA之间的调节网络与中医的整体观念类似，在病理状态下异常表达引起疾病，而在生理状态下正常表达以维系着机体的动态平衡。

2 lncRNAs与免疫炎性反应

lncRNAs能调节炎性反应细胞因子的转录及转录后调控，参与toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）、NOD样受体等炎性反应相关信号通路的调节，在机体的免疫应答及炎性反应中发挥重要作用[13]。其中，LncDC是第一个被识别的具有免疫细胞分化功能的lncRNA，它能通过抑制SHP引起的转录因子信号转导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）脱磷酸化，激活STAT3，调控树突状细胞的分化[14]。研究还发现超过有2 000种lncRNAs可表达于T细胞，调控Th细胞的特定基因编码蛋白，并选择性的调节Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的表达[15]。此外，lncRNAs对固有免疫、适应性免疫、免疫细胞发展分化及自身免疫性疾病都具有调节作用，系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化、甲状腺炎、克罗恩病等多种自身免疫性疾病中存在lncRNAs的差异表达[9]，进一步提示lncRNA可参与免疫炎性反应的发生发展。

目前已发现多种lncRNAs与免疫炎性反应的发生相关。LncRNA NEAT1（Nuclear Enriched Abundant Transcript 1，NEAT1）又称为病毒诱导的非编码RNA VINC，可通过诱导其相关联的核内旁斑蛋白剪接因子（Splicing Factor Proline/glutamine-rich，SFPQ）从IL-8启动子区域迁移到亚细胞核内旁斑内，消除SFPQ对IL-8转录的抑制作用，促进IL-8的转录激活和表达，而沉默NEAT1的表达能抑制TLR2信号活化诱导的IL6、CXCL10、CCL2、CCL8和CXCL11等下游晚期反应炎性反应因子的表达[16-17]。LncRNA PACER即p50-associated COX-2 extragenic RNA，它能与NF-κB的抑制性亚基p50相结合，潜在地促进Cox2启动区NF-κB p65/p50二聚体的结合，使p300组蛋白乙酰转移酶聚集，组蛋白乙酰化和RNA聚合酶II起始复合物的聚集增加，进一步诱导Cox2的表达，引发炎性反应[18]。lincRNA-Cox2也是一种参与NF-κB转录激活的早期原发性炎性反应基因。当细菌脂多糖LPS刺激巨噬细胞后，lincRNA-Cox2与SWI/SNF结合形成lincRNA-Cox2/SWI/SNF复合体，并调节NF-κB亚基结合到SWI/SNF复合体，引起巨噬细胞炎性反应基因SWI/SNF相关的染色质的重塑和反式激活，调控LPS诱导的炎性反应[19]。LncRNA THRIL则是一种TNF-α与异构核L核糖核蛋白（heterogenous nuclear Ribonucleoprotein L，hnRNPL）关联的免疫调节性LincRNA，位于编码BRI3结合蛋白基因的下游。THP-1巨噬细胞经激活后，lncRNAs中差异表达较明显的THRIL可与hnRNPL结合，形成THRIL–hnRNPL复合体，通过与TNF-α启动子区域结合调节TNF-α基因的转录，并参与转录后调控，其表达与急性炎症性疾病的严重程度相关[20]。

另外，也有一些lncRNAs可抑制炎性反应。lncRNA Lethe是由前炎性反应因子通过NF-κB或糖皮质激素受体激动剂诱导产生的假基因lncRNA，它能与NF-κB的亚单位RelA结合，抑制RelA DNA结合和靶基因的激活，负反馈调节NF-κB信号通路，抑制由TNF-α诱发的炎性反应[21]。Lnc-IL7R是一种经LPS诱导产生的lnc RNA，它与人IL-7R基因的3′非编码区域（3′UTR）重叠，可通过调节炎性反应递质近端启动子的组蛋白H3第27个氨基酸上三甲基化（Histone 3 Lysine 27 Trimethylation，H3K27me3）修饰，抑制LPS诱导的炎性反应，LPS诱导产生的E-selectin、VCAM-1、IL-6、IL-8在lnc-IL7R基因敲除细胞中呈现高表达[22]。lincRNA-EPS则在巨噬细胞中调控免疫应答基因IRGs的表达，它定位在IRGs的调控区域，与hnRNPL相互作用，控制核小体定位并抑制其转录，调节炎性反应，实验也证实lincRNA-ERS敲除小鼠在受到内毒素攻击后炎性反应明显增强[23]。综上，参与免疫炎性反应调节的lncRNAs。见表1。

综上所述，lncRNA参与免疫炎性反应的调节，或可从lncRNA的角度阐释炎症性肠病的发病机制。针灸能调节免疫炎性反应因子的表达，具有抗炎免疫的作用[24]。将强调中医整体观念的针灸疗法与系统生物学中的转录组学相结合，或可从整体水平揭示针灸治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病的效应及调控机制。

3 lncRNAs与炎症性肠病

基因多态性等遗传因素在IBD的发生中占有重要地位，如TLR4 rs4986790A>G和rs4986791C>T基因多态性可增加患IBD的风险，并与IBD的发病机制有一定关系[1]；基因的差异表达也在IBD的发病过程中有重要作用[25]。基因IL-10启动子KAT2B和H4K5ac的富集率减少可导致转录沉默，影响先天和适应性免疫应答，使IL-10在IBD的结肠炎症组织中表达减少，体现了IBD中关键抑炎因子IL-10失调的表观遗传修饰机制[2]。人体组织中可映射到大量IBD位点相关lncRNAs的表达，距1231个IBD候选基因5 kb的上下游区域内或周围有4272个lncRNAs[26]。与IBD主要相关的lncRNAs，如：RP11-324I22.2、AC074391.1、AC012370.2、BSN-AS1与IBD相关；其中CTC-349C3.1与UC相关，且与IBD相关的IL21/IL21-AS1位点包含了lncRNA IL21-AS1，其在Th1细胞与IL-21呈现共表达。lncRNA的功能或免疫细胞的特异性表达影响IBD的发生发展[27]。

CD患者较正常人表达上调了1211种lncRNAs，下调了777种。其中上调倍数变化较显著的有GUSBP2，RP5-968D22.1、RP11-68L1.2、RP11-428F8.2、GAS5-AS1，下调倍数变化较显著的有AF113016、ALOX12P2、AGSK1、CTC-338M12.3、AC064871.3[28]。lncRNA DQ786243与CD的严重程度相关，通过促CREB的磷酸化影响CREB和Foxp3的表达，调节Treg的功能[29]。CD患者结肠黏膜组织lncRNA与正常人相比，lncRNAs表达有254种上调，184种下调，主要有RP11-731 F5.2、MMP12、RP11-465 L10.10、RP11-44 K6.2表达上调，而主要有DPP10-AS1、PDZK1P2、DIO3OS、ANRIL（CDKN2B-AS1）下调，这些差异表达的lncRNAs可能成为CD诊断与治疗的的生物学标记[30]。

UC患者较正常人结肠组织有370种lncRNAs表达上调，主要有RP11-44 K6.2、MMP12、RP11-465 L10.10、KIF9-AS1；375种下调，主要有ANRIL（CDKN2B-AS1）、PDZK1P2、DPP10-AS1等[30]。通UC活动期患者结肠组织较对照者有1961中差异表达lncRNAs，UC活动期较非活动期有1361种差异表达lncRNAs，UC非活动期较对照者有287种差异表达lncRNAs，经筛选发现Lnc RNA IFNG-AS1的表达差异最明显，且与IBD易感基因位点SNP rs7134599相关，其位置与炎性反应细胞因子IFNG邻近，上游调节因子IFNG、IL-1、IL-6、TNF-a、IL-1β在IFNG-AS1高表达的结肠组织中被激活；动物实验小鼠UC结肠组织lnc RNA IFNG-AS1的表达升高，并正向的调节IFNG的表达，说明IFNG-AS1可能通过调节关键炎性反应细胞因子IFNG的水平在UC炎性反应中起到重要作用[31]。H19过表达致对肠上皮屏障功能的破坏，H19过表达可能是减少表达的VDR在UC结肠组织中的机制之一，H19和VDR信号之间的相互作用可能提供UC的潜在治疗目标[32]。Myc相关锌指蛋白调节DSS诱导的UC结肠上皮紧密连接（TJ）蛋白ZO-1和闭合蛋白Occludin，而miR-34c靶向MAZ调节其表达，此外，PlncRNA1和miR-34c结合在一起调节MAZ，ZO-1和Occludin的表达。PlncRNA1过表达对肠上皮屏障功能的保护作用被miR-34c的过表达逆转，协同调节肠功能障碍[33]。活动期UC患者乙状结肠组织中，有329种lncRNAs上调，126种lncRNAs下调，其中上调最显著有BC012900、AK001903、AK023330，下调最显著有BC029135、CDKN2B-AS1和BC062296，篩选出来的BC012900存在于结肠上皮和固有层细胞胞核内，采用IL-1β、TNF-α以及病原体相关的分子模式（Pathogen-associated Molecular Patterns，PAMPs）HKLM（TLR2 ligand）、LPS（TLR4 ligand）、ST-FLA（TLR5 ligand）、ODN2006（TLR9 ligand）、MDP（NOD2 agonist）等炎性反应因子刺激结肠上皮细胞后BC012900表达可增加；其位于DUSP4的下游，两者由相同的启动区域调节，但转录形式和功能不同；BC012900在结肠上皮细胞的过表达显著抑制了细胞增殖，增加了细胞凋亡的易感性，这可能是lncRNA参与UC肠道炎性反应的关键环节，有望成为UC诊断和治疗的新靶点[34]。

综上所述，lncRNA与IBD的发病密切相关。课题组前期关于miRNAs和mRNA研究，发现运用整体观念的中医针灸疗法能影响炎症性肠病结肠组织差异mRNAs及miRNAs的表达，可能是通过影响miRNA与mRNA调控网络发挥作用的[35-37]；也能影响正常大鼠结肠组织及心肌组织的mRNA表达谱[38-39]。随着表观遗传修饰研究进展，采用高通量测序及生物信息学分析的技术与方法，结合lncRNAs或有助于深入针灸治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病的效应机制的研究。

4 lncRNAs与针灸治疗IBD作用机制相结合研究的思考

IBD明确的病因和发病机制尚不清楚，目前认为遗传易感性、表观遗传修饰、免疫因素、感染、环境因素是引起慢性肠道炎症的原因[40]。从细胞水平和现代分子水平研究，发现针灸治疗IBD的主要通过抗炎免疫发挥作用的，表观遗传修饰可能参与针灸抗炎免疫的调节[40-42]。lncRNA是非编码的一部分，也属于表观遗传修饰的一种。

本课题组前期研究根据IBD的发病特点，提出“艾灸温养脾胃，调和肠腑气血”的学术观点，选气海、足三里、天枢、大肠俞、上巨虚等采用针灸治疗，对CD和UC均治疗有效[43-46]。针灸对IBD的效应机制通过UC和CD大鼠的动物实验研究，选气海、天枢穴，采用针刺和/或艾灸的干预方法，阐明了针灸对IBD的抗炎免疫调节作用。艾灸可抑制血清IL-8水平及结肠NF-κB p65和TLR-9蛋白的表达，上调抑炎因子IL-10的水平，下调UC结肠组织IL-8及ICAM-1 mRNA的表达，改善炎性反应，减轻UC小鼠结肠黏膜损伤，起到治疗作用[47-48]；隔药灸还能调节UC大鼠结肠TLR/NF-κB信号通路中的关键细胞因子蛋白如TLR2、NF-κB、IFN-β等的表达，促进UC结肠损伤黏膜的修复[49]。针灸治疗CD的研究中，隔药灸可降低靶器官结肠黏膜中的炎性反应因子TNF-α、TNFR1、SP、NK-1R、MCP-1、IL-8的表达，从而减轻肠道炎症，改善组织损伤，抑制肠上皮细胞凋亡，保护结肠上皮屏障，进而达到保护结肠的效应[50-52]；隔药灸和电针均可以降低CD大鼠结肠IGF家族及其受体IGF-1、IGF-1R、IGFBP-5等蛋白的表达，促进结肠组织结构与功能的恢复[42]。隔药灸可下调CD模型大鼠结肠黏膜IL-17、IL-23 mRNA的表达，Treg细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达[54]，缓解肠道炎症；隔药灸和电针均可下调UC大鼠结肠组织IFN-γ和IL-12 mRNA表达，上调IL-4和IL-10 mRNA表达，保持Th1和Th2细胞间平衡而改善免疫功能[55]；隔药灸也可降低UC大鼠结肠TLR4和TNF-α蛋白及其mRNA表达，控制其介导的炎症级联反应，以上初步阐释了针灸对IBD的抗炎免疫功能。但针灸的抗炎免疫调节作用是怎么发生的，缓解IBD的临床疗效是否受其他因素的影响，表观遗传修饰的非编码RNA中的lncRNA是否参与了针灸抗炎免疫的调节还需要进一步的探讨，该机制的阐明将有助于提高针灸的临床疗效。

lncRNA是基因在转录过程中的表达产物之一，多种lncRNA能通过一系列调控作用对机体的免疫炎性反应（包括IBD的发生发展）有重要作用，那么对lncRNA表达的调控也可能是针灸治疗IBD的关键机制。因此，可借鉴现代分子生物学研究方法，同时将其与针灸学相结合，运用基因芯片、高通量测序和生物信息学分析技术和方法，筛选IBD病理状态下差异表达的lncRNAs及针灸能有效逆转的lncRNAs，以深入阐释IBD的发病机制与针灸治疗IBD的效应机制。这将从整体水平揭示lncRNAs在针灸对IBD疗效机制中的作用，有助于中医整体观念理论的补充，也有利于针灸学的现代研究有更高层次的发展。

5 思考与展望

非编码RNA在表观遗传调控中扮演了重要的角色[56-57]，lncRNA作为非编码RNA的一种，其调控作用也逐渐引起人们广泛的关注。lncRNAs表达或功能的异常可介导机体的免疫应答，促进或抑制炎性反应，IBD中差异表达的lncRNAs也提示其在IBD的发生发展中有着重要作用。因此，深入探讨lncRNAs的功能及其在IBD中的免疫调控作用，可从表观遗传、转录后调控的角度开展研究，也可为IBD的临床诊断、靶向治疗等提供新方法。此外，结合整体观念和辨证论治，针灸临床采用温养脾胃，调和肠腑气血法治疗IBD，其疗效肯定，应建立疗效评价体系，同时从lncRNA-miRNA-mRNA调控网络引入中医整体观念，研究针灸调和阴阳及其抗炎免疫的作用机制。

另一方面，lncRNA与mRNA均为基因转录后的产物，针灸可通过调控IBD相关细胞因子mRNA的表达，抑制肠道促炎细胞因子的释放，减轻炎症性肠病黏膜炎性反应，调节机体免疫功能。那么针灸对IBD炎症的免疫调节作用是否受相关的lncRNA调控免疫炎性反应因子的转录有关，值得深入研究。因此，我们将结合临床研究和动物实验，通过对IBD患者和健康者结肠黏膜lncRNA和mRNA表达谱进行筛选和比较。1）研究病理状态下结肠黏膜的差异lncRNAs和mRNAs，采用生物信息学的方法分析lncRNA和mRNA的调控网络，拟揭示IBD结肠黏膜特异性lncRNAs和mRNAs，为IBD的生物标志及临床靶向诊断和治疗提供科学依据；2）采用原位杂交和非编码RNA干扰的方式深入研究IBD特异性lncRNA调控mRNA的作用机制，拟阐释IBD的部分发病机制；3）在明确针灸治疗IBD有效的基础上，观察针灸对IBD特异性lncRNA-mRNA调节网络，拟明确针灸影响的结肠黏膜炎症相关lncRNAs对免疫炎性反应因子调节机制，拟阐释中医针灸治疗IBD的部分效应机制，为针灸的临床应用提供科学的临床资料和理论依据。

将中医针灸学与现代分子生物学技术相结合必然可为针灸学发展提供广阔的前景。只有运用现代科学技术与手段，才能客观的阐释中医针灸学理论及其作用机制，充分发挥针灸在治疗IBD临床疗效方面的优势。这不仅能有利于从基因调控方面揭示针灸对IBD的作用机制，也对针灸治疗IBD的基礎及临床研究起到很大的推动作用。

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