HPLC法测定银黄片中黄芩苷和绿原酸的溶出度

王敏 贺蕊 龚慕辛 关怀 于萍 贾富霞

摘要 目的：建立中药银黄片体外溶出度测定的实验方法，为质量控制提供重要指标和参数。方法：参考《中华人民共和国药典》2015版收录的溶出度测定方法第二法-桨法，采用HPLC法，用DAD检测器，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：A-0.1%磷酸水，B-0.1%磷酸乙腈，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长为绿原酸327 nm，黄芩苷276 nm，测定自制银黄片中黄芩苷和绿原酸的溶出度。结果：黄芩苷和绿原酸分别在0.1～20 μM和0.5～30 μM范围内线性关系良好（R2=0.9996）。HPLC法可同时测定中药银黄片中黄芩苷、绿原酸的溶出度。结论：本方法快速、灵敏、准确，重现性好，可用于银黄片中绿原酸和黄芩苷的溶出度测定，为其质量控制提供重要依据。

关键词 银黄片；黄芩苷；绿原酸；溶出度

Abstract Objective：To establish the determination method of baicalin and chlorogenic acid dissolution in Yinhuang tablets so as to provide criteria and parameters for the quality control of Yinhuang tablets. Methods：The dissolution of chlorogenic acid and baicalin from Yinhuang tablets was determined by HPLC method with DAD detector and Agilent TC-C18 column （250 mm ×4.6 mm， 5 μm） by using mixture of acetonitrile and purified water both containing 0.05% TFA as mobile phase with gradient elution in the current speed of 1.0 mL/min， and the detection wavelength of baicalin and chlorogenic acid were 276 nm and 327 nm， respectively. The dissolution test was operated according to the second dissolution method-oar method recorded on the Chinese medicine pharmacopoeia 2015 edition. Results：It was demonstrated that there was a good linear relationship in the range of 0.1-20 μM in baicalin and 0.5-30 μM in chlorogenic acid （R2=0.9996）， respectively. The dissolution of chlorogenic acid and baicalin from Yinhuang tablets could be determined at the same time by the same HPLC method. Conclusion：The HPLC method was rapid， sensitive， accurate， and reproducible. It could be used to determine the baicalin and chlorogenic acid dissolution in Yinhuang tablets and provide important references for the quality control of Yinhuang tablets.

Key Words Yinhuang tablets； Baicalin； Chlorogenic acid； Dissolution

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.043

银黄片（自制）是由金银花提取物和黄芩苷制备而成，具有清热解毒、抗菌消炎作用，常用于治疗急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎和上呼吸道感染[1]。绿原酸是金银花中主要的抗菌有效成分，常用作金银花质量控制的指标。黄芩苷含量是黄芩药材的质量评价指标，具有多种药理作用。银黄片（自制）的主要有效成分是绿原酸和难溶于水的黄芩苷，其溶出释放性能对所其在体内的吸收有较大的影响，是银黄片能否起效的决定性因素。主成分或适宜物质组的溶出度检测，受到专家的重视，甚至有些专家建议将其作为中成药质量控制的项目[2-3]。为更好的控制药品的质量，避免紫外分光光度法中黄芩苷和绿原酸两成分存在的相互干扰，本研究参考《中华人民共和国药典》2015版一部0931溶出度测定方法第二法-桨法，采用高效液相色谱（HPLC）法，建立银黄片（自制）中黄芩苷与绿原酸的溶出度测定方法，为其质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，四元泵，自动进样器，DAD检测器，数据处理软件；ZRS-8LD型智能溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）。

1.1.2 试药 黄芩苷对照品（批号：110715-201318）和绿原酸对照品（批号：110753-201314），购自中国食品药品检定研究院；银黄片（自制时间：20150609，规格：0.4047 g/片）；甲醇、乙腈均为色谱纯，娃哈哈纯净水，磷酸（分析纯），盐酸（分析纯）购于北京现代东方精细化学品有限公司，无水乙醇（分析纯）购于现代东方（北京）科技发展有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 HPLC检测条件 色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A-0.1%磷酸水，B-0.1%磷酸乙腈，按照表1的梯度进行洗脱；检测波长：276 nm（黄芩苷），327 nm（绿原酸）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.2.2 黄芩苷、绿原酸混合对照品溶液的配制

精密称取3.5 mg绿原酸，以50%甲醇溶解定容至10 mL，成浓度为1 mM的绿原酸母液。精密称取4.4 mg黄芩苷，以70%甲醇溶解定容至10 mL，成浓度为1 mM的黄芩苷母液。上述样品用铝箔纸包好，置于4 ℃冰箱中待用。各取2种母液适量用50%的甲醇稀释，制成含绿原酸、黄芩苷的系列混合对照品溶液，浓度见表2。

1.2.3 溶出度试验与样品溶液制备

按《中华人民共和国药典》2015版一部0931溶出度测定方法第二法-桨法，以900 mL人工胃液作为溶出递质，进行溶出试验。将900 mL已恒定至（37.0+0.5）℃的脱气人工胃液置于溶出杯中，将精密称重的6片样品分别置于溶出杯中，调节转速为100 r/min，在5、10、25、40、60、90、120和180 min定点取样2.0 mL（随即补充同温度的递质2.0 mL），用0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试样品溶液。同时取样品10片，精密测定，求其平均片重，研细，精密称取适量（相当于平均片重），置装有900 mL人工胃液的1000 mL量瓶中，超声30 min充分溶解，吸取2.0 mL，用0.45 μm的微孔濾膜过滤，滤液作为最大溶出度液。取各供试样品溶液10 μL，按照“1.2.1”项下的色谱条件，测定黄芩苷、绿原酸的含量，计算每片的溶出度，求出平均溶出度。

溶出度=（C/C0）×（m平均/m）

其中，C-取样样品浓度；C0-平均片重的样品浓度；m平均-平均片重；m-每片的片重。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 专属性试验

对照品和样品的HPLC图谱如图1所示，绿原酸和黄芩苷的分离度良好。

1.2.4.2 线性关系考察

将“1.2.2”项下的各浓度标准品溶液，按照“1.2.1”项下的色谱条件进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到绿原酸（327 nm）的回归方程Y=10.504x+1.8935（R2=0.9996）；黄芩苷（276 nm）的回归方程Y=14.623x+12.618（R2=0.9996）。结果表明，绿原酸、黄芩苷分别在浓度0.5～30 μM，0.1 μM～20 μM线性良好。

1.2.4.3 精密度试验

取“1.2.2”项下已配置好的对照品溶液3，按“1.2.1”项下各指标成分色谱条件，重复进样5次，计算黄芩苷、绿原酸5次进样峰面积的RSD值。绿原酸、黄芩苷的RSD分别为0.6%，1.2%，提示仪器精密度良好。

1.2.4.4 稳定性试验

取“1.2.3”项下的供试品溶液室温下密封保存，于0、2、4、8、16 h取样，按“1.2.1”项下各指标成分色谱条件进样测定，计算各指标成分在各时间点峰面积RSD值，绿原酸、黄芩苷分别0.9%，1.5%，均低于3.0%，提示样品溶液16 h内稳定性良好。

1.2.4.5 重复性试验

按“1.2.3”项下溶出度供试品溶液（90 min）制备方法及样品处理方法，重复制备5份样品，按“1.2.1”项下各指标成分色谱条件进样测定，计算黄芩苷、绿原酸在各时间点峰面积RSD值，绿原酸、黄芩苷分别为0.1%、0.6%，均低于2.0%，提示该方法的重复性良好。

2 结果

以“1.2.3”项下最大溶出度溶液中绿原酸和黄芩苷的含量测定结果为100%溶出，计算绿原酸和黄芩苷在各时间点的累积溶出率，并以溶出率为纵坐标，时间为横坐标，绘制溶出曲线。绿原酸的溶出度曲线如图2所示，在180 min基本都达到100%溶出。黄芩苷的溶出速率慢于绿原酸，在180 min时，仅达到65%（图3）。

3 讨论

用分光光度计对配制的绿原酸、黄芩苷对照品母液在200～400 nm波长扫描，结果显示，绿原酸在327 nm波长处有最大吸收，黄芩苷在276 nm波长处有最大吸收，因此选择327 nm为绿原酸的检测波长，选择276 nm为黄芩苷的的检测波长，与文献报道一致[4-5]。

本研究采用HPLC法同时测定了绿原酸和黄芩苷的含量，不仅方法简便、可靠、灵敏度高、重现性好，而且避免了此前采用紫外分光光度法测定2种成分时相互间的干扰，使结果更精确、可靠。本研究发现银黄片中黄芩苷溶出慢，在3 h尚未溶出完全，极有可能影响银黄片药效的发挥。因此，在自制银黄片的处方设计时，应充分考虑辅料和工艺的选择，以使其黄芩苷的溶出度符合要求，从而充分发挥银黄片的药效。

药品溶出度试验作为一种模拟固体口服制剂在胃肠道中崩解和溶出的体外试验方法，通常被作为一种体外替代方法为体内生物等效性研究和体内外相关性研究提供信息和指导[6]。因此，溶出度试验在药物固体口服制剂的研发过程中具有重要的作用。随着中药现代化，中药制剂质量控制的理念和方法得到提升和发展。“固体制剂跟着溶出度走”，中药固体制剂溶出度试验已成为制药工业必设的一个质量控制项目，是评价制剂处方、生产工艺、制剂生物利用度的重要指标[7-10]。在中药固体制剂生产中，为达到稳定、安全、有效、可控，需要颠覆以往“重提取、重纯化、重分离、轻成型”的思想，应以溶出度作为衡量手段，真正创造出质量可靠、疗效显著的药品。

参考文献

[1]袁浩，刘永利，李冬梅.HPLC法测定银黄片中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国民族民间医药，2011，20（1）：61-62.

[2]严婷，黄方威，王金钱，等.不同厂家复方丹参片物质组溶出度研究[J].药物评价研究，2013，36（6）：442-447.

[3]魏农农，王霞，苏敏.药物溶出度试验方法研究进展[J].中国新药杂志，2013，22（10）：1119-1124.

[4]陈述，席桂同.高效液相色谱法测定银花感冒冲剂中绿原酸含量[J].世界中医药，2015，10（1）：97-99，103.

[5]郭琪，闫艳，王海波，等.HPLC波长切换法同时测定清热解毒颗粒中8个成分的含量[J].药物分析杂志，2015，35（9）：1601-1605.

[6]胡昌勤，潘瑞雪.溶出度试验评价/预测固体口服制剂生物等效性的研究进展[J].中国新药杂志，2014，23（1）：44-51.

[7]黄晓燕，丁野，郑金风，等.灯盏花素滴丸的溶出度研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：82-84.

[8]孟戎茜，郝芳芳，董婧婧，等.穿心莲内酯滴丸溶出度测定方法的研究[J].安徽医药，2013，17（5）：756-758.

[9]郑琴，周欢，钱佳，等.大川芎脉冲片的制备工艺及体外释药特性研究[J].江西中医学院学报，2013，25（2）：48-52.

[10]翟允耀，操锋，平其能，等.心脑欣滴丸中山柰酚的体外溶出度测定[J].药学进展，2013，37（2）：73-77.