猕猴桃乳酸菌饮料的研制

张业芳，唐 诗，周 艳，孙晓红*

（1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州医科大学 食品安全学院，贵州 贵阳 550000）

猕猴桃乳酸菌饮料的研制

张业芳1，唐 诗1，周 艳2，孙晓红2*

（1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550000；2.贵州医科大学 食品安全学院，贵州 贵阳 550000）

以猕猴桃为原料，以pH值和感官评价作为检测指标，依次经过菌种筛选、单因素试验及正交试验确定猕猴桃乳酸菌饮料的最佳工艺条件，并分析该饮料在保藏期期间总酚酸、维生素C以及乳酸菌含量的变化情况。结果表明，适用于猕猴桃乳酸菌饮料的最佳菌种为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），最佳发酵工艺条件为初始pH值5.0，加糖量10%，料液比1∶1（g∶mL），接种量106CFU/g，发酵温度37℃，发酵时间28 h。在此最佳工艺条件下，产品总酚酸含量174.89 mg/100 g，维生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%，活菌数对数值9.96，微生物指标符合相关标准。

猕猴桃；乳酸菌；饮料；发酵工艺；优化

乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，它是人和动物体肠道内最重要的益生菌群，具有多种生理功能，如缓解乳糖不耐受症[1]；改善人体胃肠道功能等[2]。随着人们对乳酸菌认识的不断深入，将乳酸菌应用于果蔬加工业应运而生，如乳酸菌发酵胡萝卜、龙眼、山药等[3-5]。由于接种了乳酸菌，相对于普通果蔬制品发酵果蔬制品不仅增加了益生功效，而且增进产品的风味；延长食品的保藏期，提高产品的附加值[6]。因此，发酵果蔬制品具有广阔的市场空间。

猕猴桃又称“奇异果”，由于其风味独特，营养丰富，口感酸甜，深受大众的喜爱。研究表明猕猴桃具有丰富的营养价值，含有丰富的维生素C、矿物质、膳食纤维及多酚类化合物[7]。既往对猕猴桃饮品的研究主要集中在猕猴桃果酒和果醋饮料的开发两个方面。周翠英[8]选用筛选出的酵母菌研制出口感醇厚的猕猴桃发酵果酒，刘延岭等[9]选用酵母菌对猕猴桃进行发酵，开发出一种新型的猕猴桃果醋饮料。王晓晴等[10]采用驯化的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵猕猴桃汁及脱脂乳，得到含乳的猕猴桃发酵果汁。上述猕猴桃饮料类产品猕猴桃利用不彻底，会产生大量的果渣副产物。

本研究以猕猴桃果浆作为发酵基质，进行乳酸菌发酵，研制出一种猕猴桃乳酸菌饮料。以贵州地区优势猕猴桃品种——“贵长”猕猴桃为原料，依次经过菌种筛选、单因素试验及正交试验确定猕猴桃乳酸菌饮料生产的最佳工艺条件，同时探讨其保藏期间总酚、维生素C、以及乳酸菌含量的变化情况。该研究为丰富猕猴桃加工企业的产品种类，提高其综合经济效益和产品的市场竞争力有实际意义；有利于提高猕猴桃种植户的经济收入，同时也迎合了消费者的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“贵长”猕猴桃：贵阳市修文县；植物乳杆菌（Lactobacil-lusplantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）冻干粉：山东中科嘉亿生物工程有限公司；白砂糖、柠檬酸钠、叶绿素铜钠盐、羧甲基纤维素钠（均为食品级）：市售；没食子酸（纯度≥98%）、抗坏血酸（纯度≥98%）：天津市瑞金特化学品有限公司；福林酚试剂、甲醇、乙二胺四乙酸二钠、乙酸、固蓝盐B（均为分析纯）、MRS固体培养基：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KMT-200C型多功能营养破壁机：佛山市维尔库科机有限公司；SPH-160型生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设厂；PHB-5型便携式pH计：上海晶磁仪器有限公司；LT1002C型电子天平：常熟市天量仪器有限责任公司；721型可见分光光度计：上海菁华科机仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猕猴桃乳酸菌饮料加工工艺流程

猕猴桃→打浆→调配→分装→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→成品

1.3.2 操作要点

选果、清洗：选用成熟度高、果实丰满、无霉变腐烂的猕猴桃鲜果，用清水清洗掉猕猴桃表面的毛及泥土等。

打浆：去皮后用多功能打浆机将洗净的猕猴桃破碎成浆。

调配：按6 mg/100 g添加叶绿素铜钠盐调节猕猴桃果浆的颜色，按80 mg/100 g添加羧甲基纤维素钠，添加白砂糖调整猕猴桃果浆至试验设计含糖量，并用柠檬酸钠调节pH值至试验设计水平。

分装：将处理完成后的猕猴桃果浆分装入300 g的罐头瓶中，装样量为200 g。

加热、杀菌：在83℃加热30 min以杀灭猕猴桃果浆中的有害微生物、致病菌等。

活化乳酸菌：称取所需量的活性乳酸菌冻干粉，加入10倍体积的蒸馏水，搅拌至完全溶解后放入37℃水浴锅中活化30 min，冷却发酵母液，待其温度与待发酵猕猴桃原浆温差在5℃内开始接种。

发酵：灭菌处理后的猕猴桃果浆冷却至室温，加入经活化后的乳酸菌，控制发酵温度为试验设计温度。发酵至试验设计时间，以pH降至4.8以下为发酵终点。

冷藏：发酵完成后的猕猴桃果浆冷藏于4℃冰箱。

1.3.3 发酵菌种的选择

分别选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌3种乳酸菌分别对猕猴桃进行发酵，接种量为106CFU/g，发酵温度37℃，加糖量为10%，猕猴桃和水按照料液比1∶1（g∶mL），以pH、感官评分检测指标，分析其在发酵6h、12h、18h、24h、36 h、48 h的变化情况，从而筛选出在猕猴桃果浆中生长良好的菌种。结合感官评分，筛选出能在猕猴桃果浆中生长且发酵风味良好的菌株，并用于后续试验。

1.3.4 最佳发酵工艺条件的确定

单因素试验：选取加糖量（6%、8%、10%、12%、14%、16%）、初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、料液比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（g∶mL））、接种量（103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g、106CFU/g、107CFU/g、108CFU/g）、发酵温度（31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、发酵时间（16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h），以感官评分为评价指标，进行单因素试验。每个因素重复3次。

正交试验：在单因素试验的基础上，选取发酵时间、接种量、发酵温度、料液比、加糖量、初始pH进行6因素3水平正交试验，以感官评分为评价指标，通过极差分析，方差分析得出最佳的发酵条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 感官评定

由10个品评员组成的感官评分小组参照表2对猕猴桃乳酸菌饮料进行感官评分，总分100分，试验重复3次，取平均值进行计算。评分标准见表2。

表2 猕猴桃乳酸菌饮料感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standards of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

1.3.6 理化指标及微生物指标的测定

（1）总酚的测定

取10 mL猕猴桃发酵原浆，加入30 mL体积分数为80%甲醇，在60℃、450 W条件下超声20 min，离心取上清。参照文献[11]，取0.1 mL多酚提取液，加入1 mL福林酚试剂，再加5.9 mL蒸馏水，然后静置反应6 min。加入10%碳酸钠溶液3 mL，避光静置反应30 min后于波长764 nm条件下测定吸光度值。以没食子酸标准品质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标制作标准曲线，达到标准曲线回归方程为Y=0.009 0X+0.103 5，相关系数R=0.999 7。按照标准曲线回归方程计算样品中多酚（以没食子酸计）的含量。

（2）维生素C的测定

精密吸取0.5 mL试样于10 mL比色管中，各加0.3 mL乙二胺四乙酸二钠溶液、0.5 mL乙酸溶液、1.25 mL固蓝盐B溶液（2 g/L），加水稀释至刻度，混匀下室温放置20 min，移入1 cm比色皿内，以零管为参比，于波长420 nm处测定吸光度值。以抗环血酸标准品质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标制作标准曲线，得到标准曲线回归方程为Y=0.004 1X-0.032 6，相关系数R=0.995 3。按照标准曲线回归方程计算样品中维生素C含量。

（3）微生物指标的测定

分别参照国标GB 4789.35—2010《乳酸菌检验》，GB 4789.3—2016《大肠菌数测定》、GB 4789.4—2016《沙门氏菌检验》及GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》分别对猕猴桃发酵果浆中乳酸菌、大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌进行检测。

（4）可溶性固形物

采用手持式阿贝尔折光仪。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种的选择

由图1A可知，三种乳酸菌接种到猕猴桃果浆中，发酵前6 h三株菌种活菌数的含量均下降，其中植物乳杆菌下降幅度最小，表明植物乳杆菌相对于另外两种菌更能适应猕猴桃果浆的生长条件。由图1B可知，随着发酵时间的延长pH值逐渐降低，发酵12h后pH值下降明显。由于发酵24h各菌种的含量基本达到最大，因此取该发酵时间的猕猴桃乳酸菌饮料进行感官评价。由图1C可知，植物乳杆菌发酵猕猴桃饮料感官评分最高，其次是干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌最低。结合感官评分，最终选择植物乳杆菌为发酵菌种。

图1 3种猕猴桃乳酸菌饮料的pH值、菌浓度及感官评分Fig．1 pH value，bacterial concentration and sensory score of 3 kinds of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

2.2 发酵工艺优化单因素试验

白砂糖作为植物乳杆菌发酵所需的碳源，添加量过少，植物乳杆菌生长迟缓，使产品香味不足；添加量过多，还会使口感过于甜腻[12]。由图2A可知，白砂糖添加量在6%～14%之间时感官评分呈现上升趋势，添加量为14%时，感官评分最高，随后降低。因此，选择加糖量为14%进行后续试验。

pH值的大小会直接影响植物乳杆菌的生长与代谢[13-14]，间接影响猕猴桃发酵饮料的口感。由图2B可知，随着初始pH值的变化，感官评分值呈现先逐渐升高后降低的趋势，且当初始pH为5.5时达到最高。因此，选择的起始pH值为5.5进行后续试验。

由图2C可知，料液比为1∶3到1∶1时，感官评分呈现上升趋势，在1∶1时达到最大值，随后降低。因此，选择料液比为1∶1进行后续试验。

接种量过低，发酵时间较长，产酸量低且容易受到杂菌污染；接种量过高，发酵速度虽能加快但微生物细胞易衰老，出现自溶现象[15]。由图2D可知，接种量在103～107CFU/g之间感官评分值呈现上升趋势，接种量为107CFU/g时感官评分最高，随后降低。因此，选择接种量107CFU/g进行后续试验。

发酵时间的长短会直接影响到发酵产品口感和风味。由图2E可知，随着发酵时间的延长，感官评分值先升高后缓慢降低，发酵28h感官评分达到最高。因此，选择发酵时间为28 h进行后续试验。

不同的培养温度影响代谢产物的产量和质量，以及产品的酸度、风味和组织状态[16]。由图2F可知，发酵温度在32℃到37℃之间随着温度的升高感官评分逐渐上升，37℃时达到感官评分最高，随后降低。因此，选择发酵温度为37℃进行后续试验。

图2 不同因素对猕猴桃发酵饮料pH值及感官品质的影响Fig.2 Effects of different factors on pH value and sensory quality of fermented kiwifruit beverage

2.3 发酵工艺优化正交试验表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析

Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

试验号 A B C D E F 感官评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 0 0 0 -1 1 1 1 0 0 0 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0-1 1 1 1 0 0 0 -1 1 0 -1 1 0 -1 0 -1 1 0 --1-1-1-1 1 1 0 -1 1 0 -11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 1 1 0 0 0 -1 0 0 0 -1-1-1-1-1-1 1 1 0 -1 0 --1-1 1 1 0 -1 1 0 --1-1 1 1 1 -1 1 1 0 -1 1 0 -1 1 --1-1-1 1 1 1 0-1-1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 -1 1 1 1 0 -1 83.2 78.1 83.0 83.3 83.5 82.0 75.0 80.0 76.3 85.0 88.2 80.0 82.3 74.3 80.3 86.0 87.1 88.3 77.0 77.6 85.7 81.7

续表

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，各因素对猕猴桃发酵的影响程度从高到低的次序为料液比＞初始pH＞发酵时间＞接种量＞加糖量＞发酵温度。最佳发酵工艺为A2B1C2D2E2F2，即初始pH

5.5 ，加糖量12%，料液比1∶1（g∶mL），接种量107CFU/g，发酵温度37℃，发酵时间28h。将正交试验得到的最佳工艺组合进行3次验证试验，成品感官评分达到89.2分。由表4可知，料液比对感官评价影响达到极显著程度（P＜0.01），其他因素对感官评价影响均不显著（P＞0.05）。

2.4 猕猴桃乳酸菌饮料保藏期中总酚、维生素C及活菌数的变化

表5 保藏期期间总酚酸、维生素C及活菌数的变化Table 5 Changes of total phenolic acids，vitamin C and viable count during the storage period

由表5可知，猕猴桃乳酸菌饮料在4℃保存21 d，维生素C比较稳定，仅下降3.4%，植物乳杆菌的数量随储存时间的延长逐渐降低，但始终维持在107CFU/g以上，满足活性乳酸菌的要求[17]。研究表明，低温会抑制猕猴桃中部分酶的活性，延缓多酚氧化、聚合、降解，使多酚相对比较稳定[18]。结果表明，在4℃保藏21 d能保持猕猴桃乳酸菌饮料较高的生物活性成分。

2.5 猕猴桃乳酸菌饮料质量标准

2.5.1 感官指标

色泽：绿色；气味：兼有植物乳杆菌发酵的香味和猕猴桃特有的香味，无异味：滋味：口感细腻，酸甜适中。2.5.2理化及微生物指标

猕猴桃乳酸菌饮料总酚含量174.89 mg/100 g，维生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%。

微生物指标：植物乳杆菌活菌数对数值为9.96，大肠杆菌≤3 MPN/100 mL，霉菌≤30 CFU/100 mL，致病菌未检出。

3 结论

本研究以pH和感官评分作为评价指标，通过单因素试验和正交试验确定了植物乳杆菌发酵猕猴桃饮料的最佳工艺参数：初始pH 5.5，加糖量12%，料液比1∶1（g∶mL），接种量107CFU/g，发酵温度37℃，发酵时间28 h。在此条件下制备的猕猴桃乳酸菌饮料总酚含量174.89 mg/100 g，维生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%，微生物指标符合相关标准。在4℃冷藏21 d，仍能保持较高的生物活性成分。本方法研制的猕猴桃乳酸菌饮料，采用单一植物乳杆菌作为发酵剂，生产工艺操作简单、成本低、品质优和高附加值的饮品，丰富了发酵食品的种类。

[1]赖 婷，刘汉伟，张名位，等.乳酸菌发酵对果蔬中主要活性物质及其生理功能的影响研究进展[J].中国酿造，2015，34（3）：1-4.

[2]国春艳，杜红芳，刁其玉，等.乳酸菌的生理功能及在畜牧业中的应用[J].饲料工业，2006，27（2）：55-57.

[3]周剑忠，李 莹，单成俊，等.乳酸菌发酵胡萝卜汁最佳工艺条件研究[J].江西农业学报，2008，20（7）：95-97.

[4]刘 磊，汪 浩，张名位，等.龙眼乳酸菌发酵工艺条件优化及其挥发性风味物质变化[J].中国农业科学，2015，48（20）：4147-4158.

[5]陈娟娟，周延清，王向楠.乳酸菌发酵山药果蔬饮料配方与工艺优化[J].河南师范大学学报：自然科学版，2016，44（1）：117-124.

[6]侯金丽.乳酸菌在食品工业中的应用[J].现代农业科技，2015（15）：284-285.

[7]陈招弟，陈义挺，陈 婷，等.猕猴桃的主要功能成份及其开发利用[J].热带农业科学，2014，34（8）：104-108.

[8]周翠英.猕猴桃发酵果酒的研制[J].食品研究与开发，2012，33（3）：101-103.

[9]刘延岭，杨 蕾，蒋云刚，等.猕猴桃果醋饮料的研制及成分分析[J].食品与发酵科技，2014，50（2）：72-75.

[10]王晓晴，王榆元，曾晓雄.乳酸发酵猕猴桃汁的研究[J].食品科学，2007，28（3）：151-154.

[11]赖 婷.燕麦桂圆乳酸菌发酵饮料加工活性成分变化分析与工芝优化[D].福州：福建农林大学，2016.

[12]刘佳奇，熊 涛，李军波，等.乳酸菌发酵茶饮料的工艺优化及其发酵前后香气成分分析[J].食品与发酵工业，2016，42（8）：109-114.

[13]尚天翠.温度及pH条件对乳酸菌生长影响的研究[J].伊犁师范学院学报：自然科学版，2011，2011（3）：32-36.

[14]闫 征，王昌禄，顾晓波.pH值对乳酸菌生长和乳酸产量的影响[J].食品与发酵工业，2003，29（6）：35-38.

[15]康彬彬.发芽糙米的制备及其乳酸发酵工艺的研究[D].福州：福建农林大学，2006.

[16]熊素玉，姚新奎，谭小梅，等.不同温度及pH条件对乳酸菌生长影响的研究[J].新疆农业科学，2006，43（6）：533-538.

[17]范俊华，肖志剑，张 文.植物乳杆菌发酵柚子汁复合饮料的研制[J].食品与发酵工业，2017，43（3）：140-143.

[18]王岸娜，徐山宝，吴立根.猕猴桃多酚组分及稳定性研究[J].河南工业大学学报：自然科学版，2008，29（2）：43-46.

Preparation of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

ZHANG Yefang1,TANG Shi1,ZHOU Yan2,SUN Xiaohong2*
（1.School of Public Health,Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China;2.College of Food Safety,Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China）

Using the kiwifruit as the raw material,pH value and sensory evaluation as detection indexes,the optimum technology conditions of the kiwifruit lactic acid bacteria beverage were determined by bacteria screening,single factor experiments and orthogonal experiments.The changes of total phenolic acid,vitamin C and lactic acid bacteria during the storage period of the beverage were analyzed.The results showed thatLactobacillus plantarumwas selected as the optimum strain for the beverage.The optimum fermentation process were initial pH 5.0,sugar 10%,solid-liquid ratio 1∶1 （g∶ml）,inoculum 106CFU/g,fermentation temperature 37 ℃ and time 28 h.Under the optimum process conditions,the total phenolic acid content,vitamin C content,pH value,soluble solid content and viable counts of the product were 174.89 mg/100 g,46.84 mg/100 g,4.27,18%,and 9.96 log CFU/ml,respectively.The microbiological indicators were in accord with relevant standards.

kiwifruit;lactic acid bacteria;beverage;fermentation process;optimization

TS255.3

0254-5071（2017）12-0186-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.039

2017-09-19

贵州省科技厅软科学研究项目（黔科合R字[2015]2018-2号）；贵州省教育厅青年科技人才成长计划（黔教合ky字[2016]154号）；贵州医科大学博士启动基金项目（YJ2017-1）

张业芳（1990-），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生。

*通讯作者：孙晓红（1963-），女，教授，硕士，研究方向为营养与食品卫生。