基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1

程 慧，李诗瑶，彭青枝*

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430000）

基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1

程 慧，李诗瑶，彭青枝*

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430000）

该研究提出了一种免疫比色方法用于快速检测黄曲霉毒素B1。在最优条件下，以免疫磁珠为载体，脲酶-金纳米棒为探针，探针与抗体特异性结合的同时与尿素反应催化沉积外加铜离子产生的显色反应为定量基础，紫外吸收强度作为参考指标，测定样品中的黄曲霉毒素B1。结果表明，标准曲线的线性回归方程为Y=4.017+1.430 6X，相关系数为0.997，检测限为0.042 ng/mL，加标回收率在92.5%～120.8%之间，表明该方法精密度良好、检测结果可靠。故该免疫比色法可用于检测食品中黄曲霉毒素B1。

免疫比色法；金纳米棒；脲酶；磁珠；黄曲霉毒素B1

免疫比色法因其方便快捷近年来在真菌毒素检测方面的应用较为广泛。在免疫测定系统最重要的问题是采用适当的传感器将弱免疫结合信号转化为可测量的信号。与荧光、电化学、电化学发光和质谱分析[1-4]等方法的信号转导相比，比色法因为其简单、操作方便、低成本和可视化尤其具有吸引力。然而，在免疫比色分析中涉及的主要挑战是灵敏度的局限性，这导致该分析方法无法实现真菌霉毒素的准确检测。为了解决这个问题，目前在纳米探针信号放大与过氧化物酶催化反应相结合以开发各种比色信号转导策略。由于过氧化物酶催化底物的特殊颜色变化和多标记纳米探针信号放大，许多比色免疫测定方法已成功构建[5-8]。但是，这些催化显色反应需要外加物以停止反应后获得相对稳定的比色信号。

根据之前报道合成的腙类铜离子显色剂可以与铜离子反应生成红色络合物，通过紫外-可见吸收光谱法测定该红色溶液的吸光度值或直接通过目视比色法[9]。金纳米棒（gold nanorod，Au NR）可通过控制不同合成条件形成不同的长度-直径比值，常被用作一种纳米载体来制备生物纳米探针[9-12]。

本研究制备了一种脲酶（urease）功能化金纳米棒探针，并在此基础上发展了一种基于脲酶（urease）催化铜离子沉积的新型免疫比色分析方法。金纳米探针由金纳米棒载体上负载信号抗体和高含量脲酶（urease）制备而成，将其应用于免疫磁珠构建的免疫反应以用于检测黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）。通过免疫反应定量捕获的脲酶-金纳米棒探针上高含量脲酶标记物可以催化沉积外加的铜离子。基于铜离子和腙类铜离子显色剂形成的红色络合物作为信号转导来源，建立了一种新型比色免疫法用于定量检测黄曲霉毒素B1。以期为大米及面粉等食品中黄曲霉毒素B1提供一种快速检测分析方法，进一步加快食品中真菌霉毒素快速检测的发展速度。

免疫磁珠的制备过程及其免疫比色分析原理示意如下：

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米样品：市场抽检样品。

黄曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀烯酮、桔霉素、展青霉毒素标准品（纯度≥98%）：北京中科质检生物技术有限公司；脲酶、抗坏血酸、腙类铜离子显色剂、叠氮酸钠（NaN3）、2-吗啉乙磺酸、乙基-（3-二甲基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、腙类铜离子显色剂：西格玛（中国）有限公司；纳米磁珠、铜纳米粒子：美国量子科学仪器公司；鼠抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白、驴抗鼠二抗：武汉博士德生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵、聚苯乙烯磺酸钠、磷酸盐缓冲溶液、吐温、四氢呋喃、氯金酸、硼氢酸钠、硝酸银、抗坏血酸：上海国药化学试剂公司；纳米磁珠：美国Quantum量子科学仪器公司。

1.2 仪器与设备

JEOL1010型透射电子显微镜：日本电子株式会社；UV-3100紫外-可见分光光度计：日本日立公司；AB SCIEX 4500高效液相色谱串联质谱：上海爱博才思分析仪器贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脲酶功能化金纳米棒纳米探针复合物制备

根据文献报道的晶种法制备成实验所需的金纳米棒[13-15]。首先在十二烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）和氯金酸的混合溶液中加入强还原剂硼氢酸钠制备金种子溶液，再将氯金酸、硝酸银、十二烷基三甲基溴化铵混合后加入抗环血酸制备生长液，最后将金种子溶液与生长液混合开始生长金纳米棒，48 h后离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵，向所得的5.0mL金纳米棒分散液中加入1.0 mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠（sodium polystyrene sulfonate，PSS）1.0 mL，室温混匀组装1h。离心除去过量的聚苯乙烯磺酸钠后，将其分散于1.0mL的磷酸缓冲溶液（pH 6.0）中，依次向其中加入1.0 mg/mL二抗10 μL和5 mg/mL 脲酶20 μL，混匀组装3 h后4 ℃放置过夜，在此过程中脲酶加入量不变，将二抗的加入量由2 μg、3μg、4μg、5μg、6μg递增，以此优化二抗的用量。之后将所得产物离心洗涤后，分散于5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液中封闭反应1 h。最后，将所得的脲酶功能化金纳米棒纳米探针经离心洗涤，分散于500 μL的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中，4℃保存待用。

1.3.2 免疫磁珠的制备

采用乙基-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）法将纳米磁珠的羧基与鼠抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体上的氨基偶联[16-17]。2 mg磁珠用500 μL 10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonicacid，MES）和0.05%吐温20（pH 6.0）混合溶液洗涤两次，400 μL MES（10 mmol/L，pH 6.0）重悬浮磁珠后加入2 mg/mL EDC/NHS（现配现用），置于涡旋仪上混匀使其充分悬浮，37℃活化30 min。磁分离移除上清，加入500 μL混合洗液洗涤两次，磷酸盐-吐温混合液（pH7.4，含1%BSA）重悬后加入40 μg鼠抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体于4℃混匀过夜，磁分离移除上清，用500 μL磷酸盐-吐温（phosphate buffer saline tween，PBST）混合液洗涤4次后重悬于1 mL磷酸盐-吐温混合液（pH 7.4，含0.02%NaN3，0.5%牛血清白蛋白），4℃保存备用。

1.3.3 检测方法及步骤

向制备的40 μL免疫磁珠中加入100 μL不同浓度的黄曲霉毒素B1标准样品或样品提取液，逐级稀释黄曲霉毒素B1标准品后再加入其中，室温振荡15 min后通过磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）和PBST洗净。向其中加入140 μL脲酶功能化纳米探针分散液，继续振荡10 min之后用Tris-HCl（pH 7.4）充分洗净。加入30 mmol/L的铜离子和40mmol/L尿素溶液，加入110μLpH 7.0含有10 μmol/L腙类铜离子显色剂的Tris-HCl/四氢呋喃溶液，进行显色反应得到红色溶液，通过紫外-可见吸收光谱法测定该红色溶液的吸光度值，或直接通过目视比色法进行定量分析，记录不同浓度黄曲霉毒素B1标准品对应的吸光度值以分析免疫反应的性能。

2 结果与分析

2.1 金纳米棒的表征

在模板剂十六烷基三甲基溴化铵作用下，利用晶种法制备了金纳米棒，为了更好观察晶种法制备金纳米棒的结构及紫外特征吸收峰。由图1A可知，通过透射电镜图观察到金纳米棒呈棒状结构，并且分布度较好，说明晶种生长法已成功合成金纳米棒。而且其紫外-可见吸收光谱在波长512 nm和706 nm处呈现两个明显的特征吸收，进一步证明晶种法成功制备了金纳米棒材料。

图1 金纳米棒的透射电镜图（A）及紫外-可见吸收光谱图（B）Fig．1 Transmission electron micrograph （A）and UV-visible absorption spectrogram （B）of gold nanorod

2.2 免疫反应影响因素的条件优化

图2 制备纳米探针时二抗的用量（A）、底物中尿素浓度（B）、底物中铜离子的用量（C）、免疫反应的时间（D）Fig．2 Second antibody addition （A），urea concentration in substrate （B），the copper ions addition in the substrate （C）and the immune response time （D）in preparation of nanoprobes

基于使磁珠的免疫反应有最佳的酶催化信号转导，实验分别考察了驴抗鼠二抗的用量对金纳米棒纳米探针的影响，结果见图2。由图2A可知，在抗体用量≤4 μg时，100 ng/mL黄曲霉毒素B1的信号响应随着抗体用量的增加而不断增大，直至抗体加入量＞4μg开始缓慢降低。该现象说明加入的抗体量＜4 μg时，不能足够识别AuNR/Urease纳米探针；但是过多的抗体也会影响信号转导。因此，本工作选择4 μg抗体作为合成纳米探针的最佳条件。

由图2B可知，在尿素浓度≤40 mmol/L时，100 ng/mL黄曲霉毒素B1的信号响应随其浓度的增加而不断增大，直到尿素达到40 mmol/L时吸光度的值达到最大值2.0。

由图2C可知，当铜离子浓度≤30mmol/L时，100ng/mL黄曲霉毒素B1的信号响应随其浓度的增加而不断增大，然而，在铜离子浓度为30 mmol/L时的信号响应达到最大值2.0。故本工作选择40 mmol/L的尿素溶液和30 mmol/L的铜离子作为沉积溶液的最佳组成。

温育时间是影响免疫分析性能的另一个重要因素。实验分别研究了不同温育时间下100 ng/mL黄曲霉毒素B1在免疫磁珠上的信号响应情况。由图2D可知，夹心免疫反应温育时间在30～50 min范围内，响应信号不断增大，直到温育时间达到50 min后响应基本不变。该结果说明该免疫磁珠在50 min时免疫反应可以达到饱和状态，因此实验选择50 min作为免疫反应分析的最佳温育时间。

2.3 分析免疫反应的性能

在最优的免疫反应条件下，通过紫外分光光度法考查了不同质量浓度黄曲霉毒素B1的响应情况。由图3可知，吸光度值（Y）与黄曲霉毒素B1质量浓度（X）呈较好的线性关系，线性回归方程为Y=4.017+1.4306X，相关系数R为0.997，检测限为0.042 ng/mL，这一结果与之前报道的一些基于酶联免疫的分析方法[18-20]相比都要低得多，说明该方法在食品的快速检测中更具有实际应用意义。

图3 吸光度值与黄曲霉毒素B1质量浓度的关系Fig.3 Relationship between the absorbance and the aflatoxin B1content

2.4 检测方法特异性、重复性、稳定性和可靠性

为了考察该方法的特异性，实验分别考察了黄曲霉毒素B1、赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素标准品在该免疫磁珠上的信号响应，标准品质量浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，经免疫磁珠检测，每个浓度重复3次，判断免疫磁珠的特异性，结果见表1。与黄曲霉毒素B1在该免疫磁珠上的灵敏信号响应相比，赭霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀烯酮、桔霉素和展青霉毒素在该免疫磁珠上并没有引起明显的信号响应，这一结果说明非特异性真菌霉毒素在该免疫磁珠上引起的交叉反应较小，检测方法的特异性良好。

表1 特异性试验结果Table 1 Results of specificity experiments

将同批和不同批次的免疫磁珠分别检测5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 黄曲霉毒素B1标准品，每个质量浓度重复测3次，结果见表2。检测方法的检测结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.3%～4.6%，表明该检测方法具有较好的重复性。

将同一样品分别放置0、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h后测定一次，分别记录吸光度值，结果见表3。由表3可知，高质量浓度黄曲霉毒素B1标准品（100 ng/mL）与低质量浓度黄曲霉毒素B1标准品（1 ng/mL）吸光度值在2.0 h内均变化不明显，由此可以说明样品溶液在避光冷藏条件下放置2.0 h内稳定性良好。

表2 重复性试验结果Table 2 Results of repeatability experiments

表3 稳定性试验结果Table 3 Results of stability experiments

称取3个未知黄曲霉毒素B1含量的大米各5份进行平行性试验，结果见表4。由表4可知，3个黄曲霉毒素B1含量不同的样品平行试验结果的相对标准偏差均＜10%，结果表明该方法精密度良好。

表4 精密度试验结果Table 4 Results of precision experiments

表5 加标回收试验结果Table 5 Results of adding recovery rate experiments

在大米样品中添加一定含量的黄曲霉毒素B1标准品，使最终质量浓度为2 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL。经提取回收，将高效液相色谱串联质谱、酶联免疫试剂盒所得分析结果与免疫比色法分析结果相比较，结果见表5。由表5可知，免疫比色法的回收率在92.5%～120.8%，表明将该方法用于实际样品分析具有良好的可靠性和准确度。

3 结论

本研究建立了一种基于脲酶功能化金纳米棒探针催化铜离子的一种新型免疫比色法用于检测大米中黄曲霉毒素B1。通过在磁珠上共价固定捕获抗体，免疫反应后定量捕获到免疫磁珠表面的金纳米探针可诱导沉淀外加的铜离子。金纳米棒纳米载体上负载的高含量脲酶标记物的酶催化作用和磁珠表面组装的抗体均可大大增强分析信号，从而使得该方法可得到较高的灵敏度和较宽的线性范围。标准曲线及方法学验证结果显示，方法的最低检测限为0.042 ng/mL，免疫比色法的标准线性回归方程Y=4.017+1.4306X，相关系数R=0.997；精密度试验结果RSD为1.42%～6.41%，加标回收率为92.5%～120.8%，溶液在避光冷藏放置2 h内稳定，免疫比色法检测结果与GB 5009.22—2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》液相色谱法及酶联免疫法试剂盒法的检测结果无显著性差异（P＞0.05）。结果表明该免疫比色法在实际应用中具有较好的发展前景。

[1]李军涛，候水平，姬泽薇，等.免疫荧光层析试纸条法检测食用油中的黄曲霉毒素 B1[J].中国卫生检验杂志，2015，25（7）：963-965.

[2]孔 壮，王 杨，刘军涛，等.用于促黄体生成素快速检测的电化学免疫传感器[J].微纳电子技术，2017，54（8）：528-546.

[3]王玉霞.电化学发光免疫分析在免疫检验中的应用及结果影响因素研究[J].实验与检验医学，2017，35（4）：516-524.

[4]廉慧峰，赵笑天，王蓉珍，等.超高液相色谱-串联质谱法同时测定玉米、花生、麦仁中的 9 种真菌毒素 B1[J].食品科学，2010，31（20）：360-366.

[5]陈淑贤，刘 静，吴 振，等.基于PtNPs-PV的双重放大免疫比色法检测肉中莱克多巴胺痕量残留的研究[J].现代食品科技，2016，32（1）：278-312.

[6]白文荟，刘金钏，陈爱亮.纳米金比色法在食品安全检测中的应用研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（7）：1944-1950.

[7]朱 贞，许文波，李聪永，等.一种新型诊断方法-比色法免疫学实验在检测风疹病毒中的应用研究[J].中国计划免疫，2006，12（6）：489-494.

[8]张 静，陈 琳，林 琳，等.基于谷胱甘肽识别系统的胶体金比色法快速检测水中重金属铅离子[J].食品科学，2017，35（4）：90-102.

[9]HU S L,SONG J J,ZHAO F,et al.Highly sensitive and selective colorimetric naked-eye detection of Cu2+in aqueous medium using a hydrazone chemosensor[J].Sensor Actuat B,2015,215（1）:241-248.

[10]CHENGH,XULL,LAI G S,et al.Enzymaticallycatalytic signal tracing by a glucose oxidase and ferrocene dually functionalized nanoporous gold nanoprobe for ultrasensitive electrochemical measurement of a tumor biomarker[J].Analyst,2016,141（14）:4381-4387.

[11]XUQN,YANF,LEIJP,etal.Disposableelectrochemicalimmunosensor by using carbon sphere/gold nanoparticles composite as label for signal amplification[J].Chem A Eur J,2012,18（16）:4994-4998.

[12]栾云霞，张展宁，陆安详.基于纳米金显色的非标记核酸适配体可视化检测重金属镉的方法研究[J].食品安全质量检测学报，2016，7（2）：511-516.

[13]鲁闻生，王海飞，江 龙，等.金纳米棒的制备、生长机理及纯化[J].化学进展，2015，27（17）：785-793.

[14]张龄月，陈艳伟，刘 娜，等.谷胱甘肽修饰金纳米棒的制备及与Cu2+的作用[J].高等学校化学学报，2016，37（7）：1239-1244.

[15]韩 青，钱珍珠，张瑞雪，等.金纳米棒比色探针法测定维生素C的初步研究[J].食品安全质量检测学报，2016，7（5）：1992-1995.

[16]谢 芳，赖卫华，史爱武，等.免疫磁珠富集结合酶联免疫吸附法检测酱油中黄曲霉毒素 B1[J].食品科学，2014，35（8）：208-212.

[17]管 笛，亢子佳，贾 迪，等.磁微粒酶联免疫吸附法测定玉米中的黄曲霉毒素 B1[J].食品科学，2016，37（5）：101-105.

[18]韩 青，钱珍珠，张瑞雪，等.免疫亲和柱-液相色谱快速检测面粉中黄曲霉毒素 B1的条件优化[J].食品科技，2017，42（1）：267-271.

[19]罗自生，秦 雨，徐艳群，等.金磁纳米颗粒的制备及其在表面增强拉曼光谱快速检测黄曲霉毒素B1中的应用[J].现代食品科技，2017，33（1）：145-151.

[20]谢体波，刘 红，何方洋，等.间接竞争ELISA检测试剂盒测定粮油食品中的黄曲霉毒素B1[J].食品安全质量检测学报，2015，6（7）：2834-2839.

Rapid detection of aflatoxin B1in food by dual-amplified immuocolorimetry based on urease-functionalized gold nanorods

CHENG Hui,LI Shiyao,PENG Qingzhi*
（Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test,Wuhan 430000,China）

A kind of immuocolorimetry for rapid detection of aflatoxin B1was established.Using immune magnetic beads as the carrier,urease-gold nanorods as the probe,probe and antibody specificity combined with urea reaction catalytic deposition and copper ion chromogenic reaction as the quantitative foundation,the intensity of ultraviolet absorption as reference index,the aflatoxin B1in the sample was detected under the optimal conditions.The results showed that the linear regression equation of the standard curve wasY=4.017+1.430 6X,the correlation coefficient was 0.997,the limit of detection was 0.042 ng/ml,the adding standard recovery rate was 92.5%-120.8%.It indicated that the method had good precision and reliable test results,which could be used for detection of aflatoxin B1in food.

immuocolorimetry;gold nanorods;urease;magnetic bead;aflatoxin B1

TS207.5

0254-5071（2017）12-0158-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.033

2017-09-12

国家自然科学基金项目（No.21475033）

程 慧（1989-），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品检测。

*通讯作者：彭青枝（1967-），女，研究员，博士，研究方向为食品质量与安全。