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透明质酸发酵过程的动力学模型

2017-12-28赵郁聪

中国酿造 2017年12期
关键词:兽疫透明质菌体

丁 永,赵郁聪*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院,陕西 西安 710021;2.陕西科技大学 轻工科学与工程学院,陕西 西安 710021)

透明质酸发酵过程的动力学模型

丁 永1,赵郁聪2*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院,陕西 西安 710021;2.陕西科技大学 轻工科学与工程学院,陕西 西安 710021)

构建透明质酸发酵动力学模型可反⒊发酵过程中菌体生长量、基质消耗量及透明质酸产量之间的变化规律。采用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)进行摇瓶发酵,利用MATLAB软件对透明质酸含量、还原糖残量、菌体量的实验数据进行了非线性规划,建立了透明质酸生成动力学的模型。对拟合值与实验值进行比较,发现其吻合度较好,相对误差<5%。本模型适用于培养基初糖质量浓度<30 g/L的分批发酵,为透明质酸的产业化生产放大、发酵过程的工艺设计和管理控制提供科学的依据。

透明质酸;兽疫链球菌;发酵动力学

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以β-1,3-糖苷键和β-1,4-糖苷键连接而成的二糖单位重复构成的直链粘多糖[1]。广泛存在于高等动物的结缔组织和微生物荚膜中。HA的生理功能多种多样,如其良好的粘弹性在关节腔中可起到润滑和保护的作用;可使细胞之间黏合在一起,保证了正常的细胞代谢及组织保水作用,并保护细胞不受病原菌的侵害,在皮肤中起到保持水分的作用,使皮肤具有良好的弹性和韧性。近年来用HA治疗骨关节疾病以及HA对疼痛和炎症的缓解作用,预防术后粘连和对软组织修复的显著效果[2]。透明质酸-纳米银复合凝胶在临床创伤包缚材料领Ⅱ有潜在的应用价值[3],透明质酸在癌症转移控制药物及新⒈药物载体设计有广泛应用[4]。

传统获得HA的方法是动物组织提取法,但该方法存在原料不足、工艺复杂、纯度低、生产成本昂贵等缺点。1983年日本资生堂成功开发出微生物发酵法生产的HA,从此克服了组织提取法的诸多缺点,成为现下国外主流的生产方法[5]。目前国内的HA生产厂家大多还采取组织提取法,但收率低、提纯难、成本高、质量差、难以大规模生产,无法满足国内市场的需求,还需从国外大量进口。本研究通过对兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC-39920生产透明质酸的发酵动力学进行研究,旨在为透明质酸的放大实验、发酵过程的工艺设计和管理控制提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus):陕西科技大学食品与生物工程学院诱变保藏(原始菌株编号:ATCC-39920,来源于美国国家菌种保藏中心),实验室保藏号Sz560。

1.1.2 培养基

斜面培养基:葡萄糖10g/L,牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,琼脂20g/L,灭菌前调整pH7.0、121℃灭菌20min;血琼脂平板(70 mm血平板):华美生物有限公司;

种子培养基:葡萄糖20 g/L,NaCl 5 g/L,蛋白胨15 g/L,酵母膏10 g/L,牛肉膏10 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,K2HPO41.5g/L,灭菌前调整pH7.0、121℃灭菌20min,冷却至温度低于50℃,无菌条件下加入1%优级小牛血清;

摇瓶发酵培养基:葡萄糖30 g/L,酵母浸粉20 g/L,小牛血清1%,MgSO42.0 g/L,KH2PO41.6 g/L,FeSO40.005 g/L。调pH 7.0、121℃灭菌20 min备用。

1.1.3 材料

氢氧化钠、葡萄糖(均分析纯):国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨、酵母浸粉(均生化试剂):北京奥博星生物技术有限责任公司;十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、标准透明质酸(均为分析纯):美国Amresco公司。

1.2 仪器与设备

RDX-280型不锈钢电热手提式灭菌消毒器:上海申安医疗器械厂;Q/BKYY10-91型隔水式电热恒温培养箱:上海跃进医疗仪器厂;HQL300柜式恒温摇床:中国科学院武汉科学仪器厂;TDH-1恒温空气摇床:江苏太仓仪器厂;J2-Mc高速冷冻离心机、DU640紫外-可见分光光度计:美国Beckman公司;SW-CJ-1F超净工作台:苏净集团苏州安泰空气技术公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

取10 mL液体培养基于试管中,灭菌后加入1%的小牛血清,菌种用接种环挑取一环接种于试管中,置于37℃静置培养24~36 h;重复操作活化两次。

1.3.2 种子培养

用接种环从斜面上挑取一环菌体,接于装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中培养,200 r/min、37℃培养12~24 h。

1.3.3 发酵培养

将培养好的种子接入装有50 mL发酵液的500 mL三角瓶中,接种量为5%,200 r/min、37℃培养14 h。1.3.4取样检测

每2 h取一次样品,在10 000 r/min条件下离心10 min,离心后分离上清液与沉淀分别置于4℃冰箱中保存,待检测备用并作好记录[6]。

1.3.5 计算公式

在平衡生长条件下,微生物细胞的生长速率rX的计算公式为:

式中:X为微生物细胞浓度,g/L;μ为微生物比生长速率,h-1。

由表4可以看出,解释变量与解释变量和,以及解释变量和之间都存在高度线性相关性.尽管方程整体线性回归拟合很好,但变量的参数t值并不显著,表明模型确实存在严重的多重共线性.

1.3.6 测定方法

菌体生长量的测定:按照参考文献[7]的方法测定。还原糖浓度测定:采用DNS法[6]。透明质酸浓度检测方法:采用CTAB浊度法[8]。

2 结果与分析

2.1 兽疫链球菌菌落和菌体特征

图1 发酵菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphology of fermentation strains

2.1.1 菌落形态由图1可知,菌落形态为圆形、表面干燥、褶皱、边缘粗糙、颜色为乳白色并有凸起。

2.1.2 菌体发酵过程形态变化

图2 不同发酵阶段的菌体形态Fig.2 Mycelial morphology of different fermentation phases

由图2可知,随着发酵时间的延长,菌体数量逐渐增加,并且由最初的单个菌体变成之后的多个个体相连的长链形式,培养初期菌体荚膜比较明显,从9 h之后荚膜明显的消失,其主要原因可能是菌体进入稳定期后透明质酸释放到周围环境中,荚膜也随之消失。

2.2 兽疫链球菌发酵动力学研究[9]

图3 兽疫链球菌发酵过程曲线Fig.3 Fermentation curve ofStreptococcus zooepidemicus

由图3可知,在0~1 h期间,菌体处于适应期,菌体数量没有显著增加,葡萄糖的消耗也很小;在2~5 h期间,菌体处于对数生长期,菌体体积及数量急剧增加,葡萄糖残量急剧下降;在6 h以后的时间段里,菌体进入稳定期及衰退期,残糖量变化基本不变了。透明质酸含量曲线为钟形曲线,中间会有一个峰值。在前期,随着菌体量的增加,HA含量逐渐增加;在8~12 h期间,含量达到最大值,此时期菌体正好进入稳定期,荚膜中的HA基本都已释放到培养基中去,随后的时间段里,HA分子降解,分子量降低,HA含量降低。由此可知,透明质酸主要是在稳定期产生。

2.2.1 菌体生长动力学模型的建立[10-12]

在兽疫链球菌发酵生产透明质酸的过程中,产物包括透明质酸、乳酸、乙酸等,乙酸的浓度相当低,已忽略不计。在发酵过程中,葡萄糖为唯一限制性底物,乳酸为唯一限制性产物。由图3可知,HA和乳酸的生成与菌体的生长相偶联,但当乳酸积累到一定浓度时,HA的合成速度明显变慢,说明乳酸对HA的合成具有强烈的抑制作用。同时,乳酸的产生对细胞继续合成乳酸也会产生抑制作用[13]。所以结合Andrew和Hinshelwood模型,发现下面的动力学模型能较好的拟合:

式中:μmax为菌体最大比生长速率,h-1;KS为底物半饱和常数,g/L;Ki为底物抑制常数,g/L;K1为乳酸对菌体生长的抑制常数;PLA为乳酸浓度,g/L。

2.2.2 底物消耗动力学模型

发酵过程中底物的消耗主要用于以下3个方面:一是用于菌体细胞生长;二是合成代谢产物;三是用于维持细胞生长代谢所需的基本能量。底物的消耗与微生物菌体生长及代谢产物的形成有着密切的关系。以此,建立动力学模型为:

式中:YX/S为细胞生成得率系数,即细胞生成速率与底物消耗速率之比;YP/S为产物形成得率系数,即产物形成速率与底物消耗速率之比;mS为维持细胞结构和生命活动所需能量的细胞维持系数,g/(g·s)。

2.2.3 透明质酸产物生成动力学模型

由图3可知,透明质酸的发酵为生长偶联型过程,可以用下面的动力学模型对其进行模拟:

式中:PHA为HA的质量浓度,g/L;PLA为乳酸的质量浓度,g/L;αHA为HA的偶联常数;K2为乳酸对HA合成的抑制常数。

2.3 模型参数求解

根据测定结果,应用MATLAB软件对其进行非线性规划,求得模型参数。

表1 动力学模型参数模拟值Table 1 Simulation values of kinetics model parameters

由此,得到本实验的发酵动力学模型:

(1)菌体生长动力学模型为:

(2)底物消耗动力学模型为:

(3)透明质酸生成动力学模型为:

2.4 发酵动力学模型的拟合值与实验值的比较[14-15]

模型建立后,其适用性还有待通过进一步的发酵结果对模型进行验证。结果见图4。

由图4可知,菌体生长曲线为典型的S型曲线。0~4h为适应期;4~16 h为对数生长期,HA含量峰值就出现在此时期;16 h之后为稳定期,菌体数量变化不大,HA的含量也不再增加。

图4 菌体生长动力学模型拟合值与实验值比较Fig.4 Comparison of fitted values of kinetics model and experimental values of biomass

图5 透明质酸含量动力学模型拟合值与实验值比较Fig.5 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of hyaluronic acid production

图6 底物消耗动力学模型拟合值与实验值的比较Fig.6 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of substrate consumption

图7 乳酸生成动力学模型拟合值与实验值比较Fig.7 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of lactic acid production

由图5~图7可知,所建模型能较好地反应出兽疫链球菌发酵产透明质酸的过程,底物的消耗,乳酸生成的拟合值与实验值吻合度好,相对误差<5%。

3 结论

本实验基于大量的发酵数据,通过计算机软件对透明质酸发酵动力学模型进行了非线性规划,建立了透明质酸发酵动力学的模型。除少量实验数据偏差较大之外,拟合值与实验值较吻合,达到了实验的目的。

菌体生长动力学模型显示菌体生长受到两方面的抑制因素,一项为底物抑制,另一项为产物乳酸的抑制。透明质酸生成动力学模型可知在乳酸产量较低时,透明质酸的量与生物量呈正比例关系;当乳酸量与透明质酸量积累到一定浓度时,HA的合成速度明显变慢,说明HA的合成与菌体的生长相偶联并受到乳酸的抑制作用。

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Kinetic model of the hyaluronic acid fermentation process

DING Yong1,ZHAO Yucong2*
(1.School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China;2.School of Light Industry,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China)

The construction of hyaluronic acid fermentation kinetics model can reflect the change rules between the biomass variation,substrate consumption and hyaluronic acid production in the fermentation process.The hyaluronic acid was fermented in shake flask byStreptococcus zooepidemicus,the hyaluronic acid content,reducing sugar residue content and bacterial amount were conducted with nonlinear programme,and the kinetic model of hyaluronic acid production was established by MATLAB software.The fitted value was coincided with the experimental value,and the relative error was less than 5%.The model was applicable to the batch fermentation in the medium with initial glucose concentration less than 30 g/L,and it could provide scientific basis for the industrial production amplification of hyaluronic acid,fermentation technology design and operation management.

hyaluronic acid;Streptococcus zooepidemicus;fermentation kinetics

TQ929.2

0254-5071(2017)12-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.026

2017-10-04

陕西省教育厅专项科研计划项目(14JK1089)

丁 永(1974-),男,讲师,博士研究生,研究方向为发酵工程。

*通讯作者:赵郁聪(1975-),女,副教授,博士研究生,研究方向为发酵工程。

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