北五味子酒酿酒酵母的筛选及其挥发性成分的分析

荣 军，庞惟俏，郭德军*

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.钦州学院 食品工程学院，广西 钦州 535000）

北五味子酒酿酒酵母的筛选及其挥发性成分的分析

荣 军1，庞惟俏1，郭德军2*

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.钦州学院 食品工程学院，广西 钦州 535000）

以D254、D15、2323、RC212、K1和AC 6种酿酒酵母发酵制备北五味子酒，通过感官评定和理化分析筛选适合北五味子酒发酵的酵母，并使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测技术分析其挥发性成分。结果表明，筛选出D254酵母为酿造北五味子酒的最佳酵母，HS-SPME-GC-MS法共鉴定出94种香气成分，其中共有挥发性成分11种，其含量及组成差异明显；D254酵母发酵的北五味子酒主要挥发性成分为4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇（1 327.08 ng/mL）；AC酵母和K1酵母为异戊醇（211.30 ng/mL、148.02 ng/mL）D15酵母、RC212酵母和2323酵母发酵的北五味子酒的主要挥发性成分为苯乙醇，但含量略有差异。这表明在相同的条件下，不同酵母发酵的北五味子酒产生的挥发性成分差异较大。

北五味子酒；酿酒酵母；筛选；挥发性成分

五味子（Schisandra chinensis）又称山花椒、五梅子、秤砣子等，在西方被称为“东方王子”，浆果呈球形，成熟时为穗状聚合果[1-2]。我国依据地Ⅱ、外形特征和功能效果的不同，将五味子分为北五味子和南五味子。据《神农本草经》记载，五味子有益于心脏、肝脏、肾功能的保健；并且对神经系统有抑制作用，对人体有安眠的功效[3-4]。现在城市人群生活工作节奏较快，工作压力较大，失眠人群增多，对于北五味子发酵酒的需求也逐渐增加，故而，不断开发和完善北五味子发酵酒是十分必要的。大兴安岭独特的自然环境十分适合种植北五味子，同时，北五味子中重金属含量低于南五味子。且一些功能性成分含量较高，使得其功能性和质量均较优于南五味子[5-6]。因此，合理地开发北五味子具有重要的保健价值和实践意义。

目前，对北五味子发酵酒酵母的筛选相关报道相对较少，多集中在对其发酵工艺条件的优化和功能性特点的研究。庞少华[5]确定五味子酒发酵条件为发酵温度24～28℃、发酵总酸度10 g/L，并研发出五味子-桑甚复合发酵酒。冯小雨等[7]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用检测技术（headspace-solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术在五味子酒中检出36种挥发性成分，其中酯和醇化合物的含量最多。本实验选取6种商业化葡萄酒酵母（D254、D15、2323、RC212、K1和AC）和大兴安岭北五味子以相同的酿造工艺分别进行发酵，对其进行感官评价和理化分析，并通过采用HS-SPME-GC-MS对北五味子原液和其发酵酒的挥发性成分进行测定，筛选适宜北五味子发酵的酿酒酵母，为更好地酿造北五味子酒提供优良菌株，完善其发酵风味和香气，更好地满足市场需求奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生浆果北五味子：大兴安岭超越野生浆果加工有限公司；D15酿酒酵母：黑龙江八一农垦大学食品微生物实验室保藏；D254酵母、AC酵母、RC212酵母、K1酵母、2323酵母：烟台帝伯仕自酿机械有限公司；蔗糖：大庆超市；果胶酶、对甲氧基苯甲醛、亚硫酸、福林酚、浓硫酸、氢氧化钠（均为分析纯）：上海生工生物工程股份公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪、5975质谱仪：美国Agilent公司；DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、固相微萃取装置、PDMS/DVB 50/30 μm萃取头：美国J&W Sci.公司；DK-8D电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司；722S可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TD25-WS多管架自加平衡离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子发酵酒的工艺流程及操作要点[7]

操作要点：

（1）选择饱满的北五味子果实进行破碎，便于其与酵母菌更充分接触，同时，加入适量果胶酶。

（2）酵母发酵阶段白砂糖的添加量为130 g/L，糖分两次添加，第一次加1/2，发酵4 d后，加剩余的糖。

（3）称取20 g活性干酵母用100 mL的温水（35～40℃）活化，添加活化后的酵母于北五味子果汁中进行接种，发酵温度为25℃。在发酵的6～8 d内，每天搅拌2次。

（4）后发酵的发酵终点标准为酒精度不再增加，添加硅藻土进行澄清。

1.3.2 北五味子发酵酒的感官评价

根据《葡萄酒工业手册》和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对北五味子发酵酒进行感官评价，评价的标准见表1。挑选出10位30～50岁具有经验的品评人员对北五味子发酵酒味道、香气、风格、颜色、透明度进行品评和打分。满分100分，评分标准见表1。

表1 北五味子酵酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards ofSchisandra chinensiswine

1.3.3 北五味子发酵酒理化指标测定

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》中的方法测定北五味子发酵酒的酒精度、总糖、总酚、还原糖，测定方法分别为蒸馏比重法、硫酸蒽酮比色法、电位滴定法和斐林试剂滴定法。

1.3.4 北五味子发酵酒挥发性成分的测定

北五味子酒中挥发性成分测定采用顶空固相萃取气质联用法（headspace solid-phase microextraction-gas chro matography/mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）。

（1）样品的前处理

取约15 mL北五味子酒加入40 mL样品瓶中，加入密度为1.121 g/mL对甲氧基苯甲醛内标物溶液0.2 μL。将样品瓶放入50℃的水浴中平衡10 min，将老化5 min的萃取针头插入样品瓶中，萃取40 min，用手柄将纤维头推回针头内拔出，插入GC-MS的进样器于250℃条件下解吸1 min，同时启动仪器采集数据。

（2）气相色谱分析条件

DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250℃；载气氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流进样；采用程序升温方式，由室温升至50℃保持5min，然后以6℃/min升至230℃保持15 min，随后降温至50℃。

（3）质谱分析条件

电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度225℃；传输线温度280℃；四级杆温度150℃；电子能量70 eV；溶剂延迟3 min；扫描质量范围：50～500 amu。

（4）挥发性成分定性分析

利用计算机对采集到的样品质谱图进行检索，辅助人工解析图谱，与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）02.L标准谱库进行对照匹配。

（5）挥发性成分定量分析

根据内标物对甲氧基苯甲醛的浓度，及其峰面积与被检出的挥发性成分的峰面积的比值来计算北五味子发酵酒中含有的挥发性物质含量[8]，挥发性成分含量计算公式如下：

式中：A0为内标物对甲氧基苯甲醛的峰面积；A为待测样品的峰面积；X为待测样品的含量ng/mL；m为内标物的质量，0.224 2 μg；V为处理前样品的体积 mL。

1.3.5 数据处理

统计学分析在SPSS19.0软件上运行，对原始数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 北五味子发酵酒的感官评价和部分理化性质分析

果酒的味道要求是非常重要的，因此对北五味子酒进行感官分析，并辅以理化指标测定。同时，不同的酿酒酵母发酵的北五味子酒的理化性质之间差异性显著，结果见表2。

表2 北五味子酒的感官评价及理化指标Table 2 Sensory evaluation and physicochemical indexes of Schisandra chinensiswine

由表2可知，6种酵母发酵酒的酒精度差异显著（P＜0.05），D254酵母发酵酒与AC酵母发酵酒酒精度差异显著（P＜0.05）；AC酵母发酵酒同D254酵母发酵酒与RC212酵母发酵酒总糖含量差异显著（P＜0.05）；2323酵母发酵酒与D254酵母发酵酒总糖含量差异显著（P＜0.05）；2323酵母发酵酒与AC酵母发酵酒总酚含量差异不显著（P＞0.05），但这两种酵母发酵酒与其余四种酵母发酵酒总酚含量差异显著（P＜0.05）。这6种发酵酒各项指标差异显著的原因是因为所选酵母不同导致理化性质也有所不同。D254酵母产酒能力强，残糖含量少，风味及口感佳，感官评定总分较高，为94.5分；2323酵母产酒残糖含量较多，酒味略甜且酒体浑浊，风味及口感较差。因此，D254酵母发酵的北五味子酒酒体的综合感官品质最好。

2.2 不同酿酒酵母的北五味子酒挥发性成分分析

挥发性成分的测定，有助于解释酒体味道和香气。基于被检出挥发性成分的匹配度需＞80%这一条件[8]，利用HS-SPME-GC-MS技术在6种北五味子发酵酒中共检出94种挥发性成分，具体分类结果如表3所示，可清晰地看出其主要包括20种醇类物质、21种酯类物质、10种醛酮类物质、8种酸酚类物质、21种烷烃类物质和14种其他类物质。北五味子果汁中检出的挥发性成分种类相对较少，包括10种醇（283.40 ng/mL）、3种酯（16.30 ng/mL）、1种酸（2.60 ng/mL）和醛酮（16.60 ng/mL）、13种烷烃（376.50 ng/mL）、6种其他类物质（26.40 ng/mL）；其主要挥发性成分为4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇（139.20 ng/mL）、α-长叶蒎烯（261.80ng/mL）等。经过酵母发酵的北五味子酒增加了60种挥发性成分主要是酯类和醇类，如异丁醇、异戊醇、2-甲基-1-丁醇、α-松油醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等；减少了10种挥发性成分包括喇叭萘醇、桉油烯醇、3,4-二甲基苯甲醇、D（+）-10-樟脑磺酸等。结合图1，6种北五味子发酵酒的挥发性成分的总含量大小为酵母D254＞AC＞D15＞K1＞RC212＞2323＞原液，表明酿酒酵母对北五味子发酵酒的挥发性成分的种类和含量影响较大，这与发酵酵母种类的不同有密切的关系[8]。

图1 酵母D254发酵的北五味子酒香气成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram ofSchisandra chinensiswine fermented by yeast D254by GC-MS

表3 6种不同酿酒酵母酿造的北五味子酒及原液主要挥发性成分Table 3 Main volatile components ofSchisandra chinensiswine fermented by six different kinds ofSaccharomyces cerevisiaeand normal juice

续表

续表

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2.3 北五味子发酵酒中挥发性成分的比较分析

2.3.1 醇类化合物的比较

醇类化合物不仅赋㈣北五味子浓郁的醇酒香气，同时是形成酯类化合物的前体物，并且可抑制其中杂菌的生长[12-13]。每种北五味子发酵酒中检出醇类化合物的含量均高于其他种类的化合物，其中D254酵母酿造的北五味子酒的含量最高，为2 986.14 ng/mL，是果汁的10倍。这是因为原汁在加糖后，酿酒酵母通过糖酵解途径代谢生成多种高级醇。4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇、苯乙醇、桉叶油醇、（R）-3,7-二甲基-6-辛烯醇在所有样品中均被检出，其含量在酵母D254中最高，这些化合物的含量随着发酵进行不断升高。4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇属于含有烯烃支链的醇，其呈暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息[14-15]，可用作配制食品的香辛类香精。苯乙醇具有玫瑰和茉莉花香，桉叶油醇带有药气和强烈而不持久的清凉感香气，二者均有一定防霉及杀菌防腐作用[16]。冯小雨等[11]在五味子酒中也检出少量的苯乙醇，含量为0.10%，结果表明，五味子酒中苯乙醇主要来源于酵母发酵，6种菌株发酵产苯乙醇的能力有所不同。（R）-3,7-二甲基-6-辛烯醇具有甜味的强烈玫瑰花香气[17]，未见有关于其在北五味子发酵酒中被检出的报道。α-松油醇、α-毕橙茄醇在所有发酵酒样品中检出，但未在原液中检出，表明这种挥发性成分是经酵母代谢生成的产物。喇叭茶醇、桉油烯醇、3,4-二甲基苯甲醇仅在北五味子原液中被检出，这几种醇在茶叶中被检出，具有浓郁的熟果香和蜂蜜香[18]。

2.3.2 酯类化合物的比较

6种不同的北五味子发酵酒中检出的酯类化合物的种类和含量均高于其原汁，这表明发酵后的北五味子原汁中酯类物质变化较大，D254酵母中酯类物质总含量最高为572.03 ng/mL，是果汁的25倍。酯类物质是酵母发酵过程中重要的代谢产物，其丰富酒体的醇酯香，不同酿酒酵母产生的酯对其挥发性成分影响较大，这也导致其口感和香气特点的差异[19]。本实验检出5种共有的酯类化合物，分别为乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯。这类酯化合物⒌有独特的花香和水果香气，使得北五味子发酵酒具有宜人和柔和的酯香，并且可用于香精和食物的香料中。乙酸冰片酯未在RC212酵母中检出，在原液和其他不同酿酒酵母中被检出，表明该酵母可使其分解；其可被加入到饮料中作为安全调味香精，也可用作喷雾剂、化妆品和杀菌剂[18，20]。甲酸异戊酯只在AC酵母（160.80ng/mL）和2323（5.21 ng/mL）酵母中被检出，但含量相差较大，这是因为发酵菌株的不同；王家利[20]在野生浆果红树莓中也检出该酯，其具有特殊的梨香，可增添酒的酯香。

2.3.3 酸酚类化合物的比较

不同酿酒酵母发酵生成的北五味子发酵酒中并未检出共有的酸酚类物质，在AC、D254、K1酿酒酵母酿造的北五味子发酵酒中未发现酸类物质，可进一步研究其是否可对果汁进行生物降酸，改善北五味子发酵酒的酸涩感。4-乙酰苯氧基乙酸（16.67 ng/mL）是含量最高的酸类物质仅在2323酵母中被检出，目前没有研究表明其在北五味子原汁和发酵酒中被检出，其可能是该酵母的次级代谢产物。在果汁和酵母AC、K1、RC212中未检出挥发性酚类物质，其具有抗氧化性对人体有益；同时，其在发酵过程中形成，可能导致不同北五味子发酵酒的口味、挥发性成分等质量因素不同[21]。甲基丁香酚（15.63 ng/mL）是D254酵母中主要的酚类物质，具有清甜温和的丁香、茴香辛香气，可赋㈣北五味子酒独特的香气。

2.3.4 醛酮类化合物的比较

6种北五味子发酵酒中检出羰基化合物的种类相对较少，均未超过10种。在D254酵母中醛酮类化合物含量最多，为96.69 ng/mL，含量是D15酵母的56倍，是果汁的6倍。其中含量最高的醛和酮化合物均是在D254酵母中被检出，分别是苯甲醛（19.27 ng/mL）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（33.33 ng/mL），二者均具有水果香气，均可作为食品加工中的增香香精。在果汁中仅检出一种酮类物质为β-紫罗兰酮（16.60 ng/mL），是一种极其重要的日化、食品香料，用以配制树莓、樱桃、葡萄、草莓等型香精，并大量用于生产维生素A（vitamin A，VA）、维生素E（vitamin E，VE）和胡萝卜素[22]。

2.3.5 烷烃类和其他类化合物的比较

北五味子酒中鉴定出的烷烃类成分主要是由烯烃化合物，仅检出2种烷烃化合物，这也充分证明其含有丰富且具功能性的三萜类物质。在D254酵母中检出的烯烃类含量和种类最多，分别为247.39 ng/mL和10种，其中主要的是萜品油烯（49.48 ng/mL），有清新的柠檬气味[23]，可使酒体变得柔和。1,4-桉叶素、（+）-花侧柏烯为所有样品的共有成分，前者在发酵酒中的含量是果汁的7～33倍，随着发酵的进行含量增加；而后者含量随着发酵的进行呈波动性变化，这可能与酵母、温度有关[24]。β-蒎烯（2.80 ng/mL）、依兰烯（24.50ng/mL）、（Z）-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯（1.50ng/mL）在果汁中被检出；戴好富等[25]在北五味子中也检出质量分数为0.22%的β-蒎烯，而未在北五味子酒中被检出，可能其随着发酵的进行不断挥发或是被酵母利用生成醇类化合物增加酒香。玫瑰醚、2-异丙基-5-甲基-1,4-苯并醌在所有样品中被检出，具有玫瑰香的玫瑰醚在D254酵母中含量最高为62.50 ng/mL，含量是果汁的36倍，其含量在酒发酵结束之后含量升高，可增加酒体的丰富度。

6种北五味子发酵酒中检出的主要挥发性成分的种类比较复杂，包括醇类和酯类化合物，含量较高，所以对发酵酒的香气起到主要作用，其余种类化合物的含量较少，对北五味子发酵酒的影响较弱。

3 结论

以感官评定为主要指标，筛选出D254酵母最适合发酵北五味子酒，其酒体丰满，味道丰富，果香纯正，呈宝石红色，醇厚协调，无苦涩感，酸甜适口。北五味子酒的理化指标也表明，D254酵母产乙醇高、残糖低。挥发性成分测定结果也表明其产生的发性成分种类多、含量高，这也很好地解释了该菌株发酵北五味子酒味道丰富的原因。

不同酵母发酵的北五味子酒所产生的挥发性成分差异显著。6种酵母酿造的北五味子酒，共鉴定出94种挥发性成分，其中11种挥发性成分为共有成分。D254、D15、2323、RC212、K1、AC酵母发酵的北五味子酒中分别检测出56、36、41、46、40、45种香气成分。 D254酵母发酵的北五味子酒挥发性主成分为4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇（1 327.08 ng/mL）；酵母D15，2323和RC212发酵酒中的主要香气成分为苯乙醇，含量分别为158.30ng/mL、102.10ng/mL、159.85 ng/mL；酵母AC和K1发酵的主要香气成分为异戊醇（148.02 ng/mL、211.30 ng/mL）。这表明，酵母的选取对北五味子酒香气成分的形成具有重要的影响。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaefromShisandra chinensiswine and analysis of volatile components

RONG Jun1,PANG Weiqiao1,GUO Dejun2*
（1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535000,China）

Shisandra chinensiswine was brewed by six kinds ofSaccharomyces cerevisiae （D254,D15,2323,RC212,K1and AC）.The yeast was selected forS.chinensiswine by sensory evaluation and physical and chemical analysis,and its volatile components were analyzed by HS-SPME-GC-MS.The results showed that the yeast D254was selected as the optimum yeast for the wine-making.A total of 94 kinds of aroma components were identified with 11 kinds of the common volatile components.There were great differences in the contents and components.The main volatile component of S.chinensiswine by yeast D254was 4-methyl-1-1-methylethyl-3-cyclohexene-1-ol（1 327.08 ng/ml）,the main volatile component ofS.chinensiswine by yeast AC and K1was isoamyl alcohol （211.30 ng/ml and 148.02 ng/ml）,the main volatile component ofS.chinensiswine by yeast D15,RC212 and 2323 was phenethyl alcohol,but the contents were a little difference.Results indicated that there were great differences in the volatile components ofS.chinensiswine by different yeast fermentation under the same condition.

Schisandra chinensiswine;Saccharomyces cerevisiae;screening;volatile components

TS262.91；O657.63

0254-5071（2017）12-0076-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.016

2017-08-11

黑龙江农垦总局技术开发项目（HNK13KF-15-01）

荣 军（1973-），男，助理工程师，硕士，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：郭德军（1968-），男，博士，教授，研究方向为食品微生物。