抗羊肚菌菌丝特异性抗原单克隆抗体的制备与初步鉴定*

顾张杰，傅泽茜，石 宇，梁 勇，史广用，曲凯歌，王一东

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

抗羊肚菌菌丝特异性抗原单克隆抗体的制备与初步鉴定*

顾张杰，傅泽茜，石 宇，梁 勇，史广用，曲凯歌，王一东**

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

为利用免疫学技术研究羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pers.]菌丝生长发育规律，以菌株代号为51589的羊肚菌菌丝破碎液为抗原免疫Balb/c鼠，将致敏Balb/c鼠的B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经镜检和ELISA间接法检测，筛选出一分泌抗羊肚菌菌丝抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为W2F3。经传代培养和亚克隆纯化，得到稳定分泌抗羊肚菌菌丝抗原单克隆抗体的细胞株，经鉴定W2F3单克隆抗体抗体亚类为IgG1，轻链亚型为Kappa，初步确定该单抗对应的抗原具有羊肚菌属特异性。

羊肚菌；特异性抗原；单克隆抗体

羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pers.]属子囊菌亚门 （Ascomycotina） 盘菌纲 （Pezizomycetes） 盘菌目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌属（Morchella），是1种珍稀食（药） 用菌，味道鲜美，具有较高的营养和保健价值[1-4]。由于人们对它的生活史了解不完整，目前还无法实现稳定的大规模人工栽培，价格居高不下，因此对羊肚菌菌丝发育、子实体形成等生活史的研究具有重要的经济和理论研究价值[5]。免疫学技术尤其是单克隆抗体技术在对特异性抗原的定位、跟踪、检测等方面的研究具有得天独厚的优势[6-7]，本研究即利用经典的杂交瘤技术制备抗羊肚菌菌丝特异性抗原单克隆抗体，并对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。抗羊肚菌单克隆抗体尤其是识别羊肚菌特殊生命阶段的标识性抗原的单克隆抗体的制备，将为人们认识、了解羊肚菌一些特殊生命现象发生条件与规律提供技术方法支持，进而为了解羊肚菌的生活史，实现羊肚菌的人工栽培提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种、细胞株与实验动物

羊肚菌（Morchella esculenta） 51589，宽圆羊肚菌（M.rotunda） 50759，购于中国农业微生物菌种保藏中心。

2B2和2G9，本实验室分离得到的羊肚菌单孢子菌株[8]。

羊肚菌子实体1，于2015年5月采于吉林省四平市伊通满族自治县；羊肚菌子实体2，2016年5月采于吉林省长春市净月潭国家森林公园。

金针菇（Flammulina velutipes）、黑木耳（Auricularia auricula），购于吉林农业大学菌物研究所。

Balb/c鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，吉林大学农学部惠赠。

Balb/c鼠，雌性，8周～10周龄，购于北京华阜康生物公司。

1.1.2 试剂

RPMI Medium 1640，Invitrogen Corporation公司产品；小牛血清，杭州四季青公司产品；PEG（分子量4 000），北京鼎国生物技术有限责任公司分装；HAT、HT、TMB，Sigma公司产品；HRP标记山羊抗鼠IgG(H＋L)，购于北京中杉金桥生物技术有限责任公司；小鼠单克隆抗体Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒，购于洛阳佰奥通实验材料中心；其他试剂为国产分析纯化学试剂。

1.1.3 主要仪器设备

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；XD30倒置显微镜，宁波舜宇公司；Galaxy 170S CO2培养箱，Eppendorf公司产品；HZQ-QX全温振荡器，东联电子技术开发有限公司；ELx80TM酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 羊肚菌菌丝抗原液的制备与Balb/c鼠免疫

根据前期的工作经验[9-10]，操作如下。

（1）羊肚菌菌丝抗原液制备

无菌挑取适量标准羊肚菌菌种（51 589株）接种于无菌的含125 mLPDA液体培养基的250 mL三角瓶中，将三角瓶瓶置于温度为22℃、转速为110 r·min-1的恒温震荡器中培养。3 d后收集培养得到的菌丝（球）用蒸馏水洗涤离心3次后进行冷冻，置冻干机中冻干至恒重。称取0.74 g的冻干菌丝置于研钵中，加入适量无菌海砂研磨15 min，加入适量磷酸盐缓冲液（pH7.4，以下简称PBS），收集研磨混合物于离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液4.9 mL，该上清液即为羊肚菌菌丝标准抗原液，置于4℃冰箱保存备用。

（2） 免疫

用制备的羊肚菌菌丝抗原溶液对4只8周～10周龄的雌性Balb/c鼠进行腹腔注射0.5 mL，共免疫3次，每次间隔1周。第3次免疫1周后，断尾取血检测血清效价，以检测免疫效果。准备取脾制备B细胞悬液。

1.2.2 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选

（1）细胞培养液的准备

不完全1640培养液、小牛血清、双抗、HAT培养液、HT培养液按文献 [11]处理，无菌环境下经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装后4℃或-20℃保存。双抗的工作浓度为青霉素100 U·mL-1、硫酸链霉素100 μg·mL-1。完全1640培养液为含有10%小牛血清的不完全1640培养液（含双抗）。

（2） 细胞融合

参照文献 [11-12]进行如下操作。

饲养细胞准备：取1只小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5 min后，于超净工作台中无菌操作制备小鼠腹腔细胞悬液，按2×104个/孔加入96孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养箱中培养，饲养细胞应在融合前的1 d～2 d准备。

脾细胞准备：取免疫后的Balb/c鼠，眼球放血（收集分离血清做抗体阳性样本），颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5 min后在超净工作台内无菌取脾，研磨，制备脾细胞悬液，计数，37℃、5%CO2培养箱中备用。

细胞融合：将作为细胞融合剂的50%PEG溶液（青霉素瓶中加入1 gPEG粉与1 mL不完全1640培养液，密闭封装，121℃高压蒸汽灭菌20 min）置于37℃恒温培养箱中备用。将提前准备好的脾细胞（8.7×107个） 与在HAT选择性培养基中不能生长且处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0（1.0×107个）于15 mL离心管中混合，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清。37℃水浴中滴加PEG溶液，每3秒滴加1滴，共20滴（约1 mL）。静置90 s，然后5 min内加入10 mL37℃预热的不完全1640培养液（第1分钟加1 mL，第2分钟加4 mL，剩余液体 min内加完）。1 000 r·min-1离心5 min，弃上清。向离心管中加入10 mL37℃预热的不完全1640培养液并轻轻悬浮细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清。将得到的细胞溶于20 mL37℃预热的HAT培养液，轻轻吹打细胞使其悬浮后，以每孔约100 μL（2滴） 加入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、5%CO2培养箱中培养。

（3）杂交瘤细胞的筛选

ELISA间接法的建立，具体操作如下。

包被：51589菌丝破碎液（制备方法同1.2.1（1）），用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液适当稀释，每孔100 μL包被酶标板，4℃过夜。用含有0.05%吐温20的PBS洗涤液洗涤3次，每次3 min，甩干（此过程以下简称洗涤），4℃备用。

一抗：待测杂交瘤细胞上清，100倍稀释的阳性血清为阳性对照，没有克隆细胞团的孔中的培养液上清为阴性对照，每孔100 μL，37℃温育1 h后洗涤。

二抗：HRP标记山羊抗鼠IgG(H＋L)，浓度为1:5 000，每孔100 μL，37℃温育1 h后洗涤。

显色：按底物缓冲液∶TMB∶H2O2=2 000∶20∶3 配成显色液，每孔100 μL，显色15 min。

终止显色：每孔加入 50 μL2 mol·L-1的 H2SO4终止反应。

结果：用酶标仪检测各孔OD值，并记录分析。

杂交瘤细胞的筛选：融合7 d后开始镜检，仔细观察每一个细胞培养板孔，发现并记录（可在孔板上用记号笔做标记）每个杂交瘤细胞团，当细胞培养板孔内杂交瘤细胞团长到约占整个孔底的1/3时，每孔无菌吸取100 μL上清进行ELISA间接法检测，并向吸取上清后的孔中每孔补加100 μLHAT培养液。根据细胞的生长情况，第1次检测3 d～5 d后，同样方法再检测1次，并补加HT培养液。选取检测结果中阳性最高的孔，将孔中的杂交瘤细胞转移扩大培养，细胞培养液由HT培养液逐渐过渡到完全1640培养液。

1.2.3 杂交瘤细胞亚克隆与抗体的制备

由于杂交瘤细胞团中可能存在不分泌抗体的瘤细胞，所以应该尽早进行亚克隆操作。亚克隆操作步骤如下。

饲养细胞准备，方法同1.2.2（2）中的饲养细胞准备。

取待亚克隆的杂交瘤细胞加入15 mL离心管中，加完全1640培养液至10 mL，1 500 r·min-1离心5 min，倒掉上清再加完全1640培养液，将细胞悬液稀释到10个·mL-1（每板需10 mL，共100个细胞），100 μL·孔-1加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，将细胞培养板放入37℃、5%CO2培养箱内培养。

7 d后观察到细胞培养板中出现小杂交瘤细胞团，标记，待杂交瘤细胞团长到占整个孔底的1/3时，无菌抽取被标记的孔中的上清进行ELISA检测，每孔抽取100 μL并同时补加完全1640培养液。将阳性孔中的杂交瘤细胞转移扩大培养。

经过数次传代培养和2次亚克隆操作，获得比较稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集该杂交瘤细胞培养上清液，该上清液即为含有单克隆抗体的溶液。细胞株进行超低温冻存。

1.2.4 抗体亚型鉴定

取亚克隆后的杂交瘤细胞的上清，依照说明书用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对其进行鉴定。

1.2.5 抗体特异性检测

（1） 包被

制备方法同1.2.2（3），将51589菌丝破碎液、50759菌丝破碎液、2B2菌丝破碎液、2G9菌丝破碎液、羊肚菌子实体1破碎液、羊肚菌子实体2破碎液、金针菇菌丝破碎液、黑木耳菌丝破碎液，用包被缓冲液稀释，以包被缓冲液作为空白对照。100 μL·孔-1，4℃过夜，洗涤。

（2） 一抗

8倍稀释的W2F3细胞上清液，每孔100 μL，37℃温育1 h，洗涤。剩余步骤参照1.2.2（3） 中ELISA间接法的建立。

2 结果与分析

2.1 细胞融合结果

进行6次细胞融合（平行试验），共1 536个细胞培养孔，其中358个孔中有杂交瘤细胞团，242个孔中为单克隆细胞团。部分单克隆孔中的上清进行ELISA检测，结果见表 1。表 1中 1B11、1D9、1E10等代表细胞培养板孔的标号，“＋”孔中加入的100倍稀释阳性血清，作为阳性对照，“-”孔中加入的没有克隆细胞团孔中的培养液上清，作为阴性对照。

由表1可知，以P/N≥2.1为判定标准，2F3中的单克隆细胞团为阳性（命名为W2F3），1D9和6C4中的单克隆细胞团有阳性的趋势。

表1 部分含单克隆细胞团孔中上清的ELISA检测结果Tab.1 ELISA results of supernatant of monoclonal cell pellets

2.2 抗体亚型鉴定结果

依照鼠单抗亚型鉴定ELISA试剂盒说明书对W2F3进行鉴定，结果表明，W2F3抗体亚类为IgG1，轻链亚型为Kappa。

2.3 抗体特异性检测结果

利用ELISA间接法对杂交瘤细胞W2F3的上清液进行检测，以P/N≥2.1判定为阳性，结果见表2。

表2 单克隆抗体W2F3特异性检测结果Tab.2 Results of specific detection of monoclonal antibody W2F3

由表 2可知，W2F3与 51589、50759、2B2、2G9、羊肚菌子实体ELISA检测均显阳性反应，与金针菇、黑木耳均无交叉，说明W2F3所对应的抗原是羊肚菌的特异性抗原。

3 讨论

理论上可以通过单克隆抗体技术对羊肚菌生活史中所有阶段菌丝的所有抗原进行精确的识别与定位。实际工作中可以通过筛选羊肚菌生活史中不同阶段有代表性的标识性抗原，并制备相对应的单抗建立检测方法，进而去发现羊肚菌菌丝的发育变化条件与规律及羊肚菌的生活史。在标识性抗原的筛选上，可以通过分子生物学、生化分离技术方法纯化羊肚菌标识性抗原，可以较容易地制备只针对单一抗原、亲和力更强的抗羊肚菌菌丝特异性抗原单克隆抗体；或者用杂抗原免疫，通过传统的杂交瘤技术、噬菌体库展示技术等手段调取所需抗原的单克隆抗体。

在本实验研究中我们利用传统的杂交瘤技术，以杂抗原免疫小鼠，筛选出1株抗羊肚菌菌丝特异性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株W2F3，对其进行初步鉴定。W2F3单抗对应抗原的结构与功能及其在菌丝细胞的分布等，还有待进一步的研究确定。本研究说明用传统的杂交瘤技术制备抗羊肚菌单克隆抗体是可行的，这为制备识别羊肚菌菌丝不同生长阶段中标识性抗原的单抗提供了1种可行的方法参考。

通过收集杂交瘤细胞培养上清液或将杂交瘤细胞接种到Balb/c鼠腹腔内收集腹水以获得单克隆抗体，本研究使用的W2F3单抗是W2F3杂交瘤细胞株的培养液上清。初步的特异性检测结果显示该单抗对应的抗原具有羊肚菌属特异性，可以在此基础上进行更广范围的菌属特异性检测试验，如果满足菌属特异性条件的话，该单抗可以作为菌属和菌种的鉴定使用。

经过2次亚克隆操作和30余代的传代培养，对W2F3培养上清液进行亚型鉴定，结果为W2F3抗体亚类为IgG1，轻链亚型为Kappa，可以初步证明该抗体为单克隆抗体。在融合后镜检观察96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞的过程中，发现饲养细胞中巨噬细胞吞噬杂交瘤细胞团造成杂交瘤丢失的现象，通过将饲养细胞的数量从2×104个/孔降到1×104个/孔，可有效降低吞噬现象的发生。

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Preparation and Preliminary Identification of Anti-Morchella Hyphae Specific Antigen Monoclonal Antibody

GU Zhang-jie,FU Ze-xi,SHI Yu,LIANG Yong,SHI Guang-yong,QU Kai-ge,WANG Yi-dong
（School of Life Science and Technology,Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022,China）

In order to study the growth and development of Morchella esculenta hyphae by immunological technology,Balb/c mice were immunized with the strain 51589 of M.esculenta hyphae,and B cells of sensitized Balb/c mice were fused with myeloma cells(SP2/0),screening out a monoclonal antibody against M.esculenta hyphae named W2F3 by microscopic examination and ELISA indirect detection.The monoclonal antibody against M.esculenta hyphae was obtained by subculturing and subcloning,and the subclass of W2F3 was identified as IgG1 and the light subtype was Kappa.It is tentatively determined that the antigen corresponding to the monoclonal antibody is specific to M.esculenta.

Morchella esculenta;specific antigen;monoclonal antibodies

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0064-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.014

吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目（吉教科合字 [2016]第384号）；长春理工大学“大学生创新创业训练计划项目”（2016G041）。

顾张杰（1997-），女，在读本科生，主要研究方向为免疫学检测。E-mail:1134551326＠qq.com

**通信作者：王一东（1962-），男，本科，高级实验师，主要从事食品与卫生检验研究。E-mail:wyd＠cust.edu.cn

2017-09-16