3种生长素对蛹虫草液体发酵的影响

郑 鑫，陶春雨，徐嘉潞，陈妍胥，谢鲲鹏

（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116081）

3种生长素对蛹虫草液体发酵的影响

郑 鑫，陶春雨，徐嘉潞，陈妍胥，谢鲲鹏*

（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116081）

研究了3种生长素，吲哚丁酸（IBA）、α-萘乙酸（NAA）、2,4-D在不同浓度下对蛹虫草液体培养的影响。通过测定不同浓度下蛹虫草生物量以及胞内、胞外多糖的含量，确定了3种生长素使用的最佳质量浓度，并对各浓度下蛹虫草的生长情况进行了分析与讨论。结果表明，在生物量方面，IBA的质量浓度为3 mg·L-1时达到最大为21.50 g，比对照组提高了11.30%。NAA的质量浓度为1 mg·L-1时达到最大为16.20 g，比对照组提高了32.80%。2,4-D对蛹虫草生物量的累积起抑制作用。在胞外多糖方面，IBA和2,4-D均起抑制作用，NAA在1 mg·L-1时起抑制作用，但其质量浓度为5 mg·L-1时，胞外多糖累积量达到最大为85.60 mg，比对照组提高了80.30%。在胞内多糖方面，3种生长素均起促进作用。当加入质量浓度为1 mg·L-1的NAA时，胞内多糖累积量达到最大为117.93 mg，比对照组提高了275.36%。

生长素；蛹虫草；液体培养；虫草多糖

蛹虫草（Cordyceps militaris） 又叫北冬虫夏草，是1种能寄生于多种鳞翅目昆虫蛹和幼虫的虫草菌[1]，为子囊菌亚门（Ascomycotina） 子囊菌纲（Ascomycetes） 肉座菌目 （Hypocreaceae） 虫草属（Cordyceps） 真菌，蛹虫草可代替冬虫夏草入药[2]。从蛹虫草中提取的活性物质具有降血压、抗肿瘤、抗疲劳和调节免疫功能等重要作用[3]。其中，虫草多糖是蛹虫草的主要活性成分[4]。因野生蛹虫草较为稀少，导致其价格昂贵。植物生长调节剂是在植物激素基础上发展起来的一类人工合成的化学物质，具有与植物天然激素相同的活性作用[5]。IBA可影响植物生根过程中部分生理生化变化[6]。NAA是1种外源生长调节激素，2,4-D和NAA在低浓度下有促进作物生长发育作用[7-8]。

目前已有学者将生长素用于巨大口蘑、香菇、黑木耳、白灵菇、平菇[9-13]的培养，但其在蛹虫草液体发酵方面的研究还鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

蛹虫草菌种，由辽宁师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

吲哚丁酸、α-萘乙酸、2,4-D（分析纯），由辽宁师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、硫酸镁1.5 g、磷酸二氢钾3 g、维生素B110 mg，pH6。

液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、硫酸镁1.5 g、磷酸二氢钾3 g、维生素B110 mg，pH6。

1.3 培养方法

1.3.1 菌株活化

将保藏的菌种接于新制的斜面培养基上，25℃培养7 d。待菌种长满斜面后，用接种铲取出2 cm2的斜面菌种接于100 mL液体培养基中，于25℃恒温培养箱静置48 h，再置于25℃、120 r·min-1摇床上震荡培养5 d，制备液体菌种用于下一步试验。

1.3.2 液体培养

分别将各生长素添加到液体培养基中，使各生长素的终浓度分别为 0、1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1，每个浓度设置3个重复，250 mL三角瓶装液100 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至室温后按5%接种量接入液体菌种，于25℃、120 r·min-1摇床上振荡培养3 d。

1.4 测定方法

1.4.1 菌丝体生物量的测定

湿重：取20 mL培养液，4 000 r·min-1离心20 min，水洗，再离心，重复3次。收集菌丝体，电子天平称量。

干重：按上述方法离心、水洗，沉淀物60℃烘干至恒重，冷却到常温，电子天平称量[14]。

1.4.2 多糖的提取和测定

胞外多糖的提取：取培养液，减压浓缩至20%，加入3倍体积95%乙醇醇析12 h，沉淀多糖，4 000 r·min-1离心10 min，沉淀用无水乙醇、丙酮各洗1次，60℃烘干，得灰白色粗多糖[15]。

胞内多糖的提取：将烘干后的菌丝体粉碎，称5 g粉末加入25 mL蒸馏水，95℃～100℃水浴浸提2 h后，用蒸馏水定容至25 mL，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置沉淀 12 h，4 000 r·min-1离心 10 min，弃上清，沉淀为多糖[16]。

多糖的检测：苯酚-硫酸比色法[17]。

2 结果与讨论

2.1 生长素对蛹虫草生物量的影响

2.1.1 生长素对湿重的影响

添加不同浓度的IBA、NAA和2,4-D对湿重的影响见图1。

图1 生长素对蛹虫草湿重的影响Fig.1 Effects of auxin on the wet weight of Cordyceps militaris

由图1可知，IBA浓度为1 mg·L-1时湿重小于对照组，即低浓度的IBA抑制菌丝生长，但当IBA浓度升至3 mg·L-1时湿重最重，比对照组增加了3.2 g/20mL，提高了16.58%。NAA浓度为5 mg·L-1时湿重小于对照组，即高浓度的NAA抑制菌丝生长，但当浓度降至1 mg·L-1时湿重最重，比对照组增加了4.4 g/20mL，提高了22.80%。2,4-D处理的湿重均低于对照组，即对菌丝生长起抑制作用。陈申宽等[18]研究发现，适当浓度的NAA促进平菇菌丝生长，使其生长速度加快、生长势强壮，加速对培养料的分解、吸收、运输和积累。

2.1.2 生长素对干重的影响

添加不同浓度的IBA、NAA和2,4-D对干重的影响见图2。

图2 生长素对蛹虫草干重的影响Fig.2 Effects of auxin on the dry weight of Cordyceps militaris

由图2可知，IBA浓度为1 mg·L-1时干重小于对照组，但当其浓度升至3 mg·L-1时干重最重，比对照组增加了2.0 g/20mL，提高了16.39%。NAA浓度为5 mg·L-1时干重小于对照组，但当其浓度降至1 mg·L-1时干重最重。比对照组增加了4.0 g/20mL，提高了32.79%。2,4-D处理的菌株干重均低于对照组，对菌丝生长起抑制作用。

2.2 生长素对蛹虫草多糖的影响

2.2.1 生长素对蛹虫草胞外多糖的影响

将添加了不同浓度生长素的培养液离心，取上清液，并稀释50倍，测定490 nm处吸光值，由多糖标准曲线得到相应胞外多糖含量。具体的结果见表1。

表1 胞外多糖含量测定结果Tab.1 Determination results of extracellular polysaccharide content

由表1可见，IBA处理后，胞外多糖含量均低于对照组，即IBA对胞外多糖的累积起抑制作用。NAA 在 1 mg·L-1～3 mg·L-1范围内，试验组数值均低于对照组，当浓度升至5 mg·L-1时，试验组胞外多糖含量达到最大，为85.604 mg，比对照组提高了80.35%，即NAA在低浓度时抑制胞外多糖的累积，而在高浓度时起促进作用；2,4-D处理后，胞外多糖含量均低于对照组，即对胞外多糖的累积起抑制作用。

2.2.2 生长素对蛹虫草胞内多糖的影响

将浸提得到的胞内多糖稀释50倍，测定490 nm处吸光值，由多糖标准曲线得到相应的胞内多糖含量。具体结果见表2。

表2 胞内多糖含量测定结果Tab.2 Determination results of intracellular polysaccharide content

从表2可以看出，加入3种生长素后，胞内多糖的含量均明显增加。当IBA的浓度在1 mg·L-1～5 mg·L-1范围内，随着浓度的增加，胞内多糖含量逐渐增加。当NAA浓度为1 mg·L-1时，胞内多糖产量达到最大117.93 mg，比对照组提高了275.36%，此后随浓度的增加，胞内多糖含量累积逐渐减少；当NAA浓度为5 mg·L-1时起抑制作用，即NAA在低浓度时促进胞内多糖的累积。2,4-D处理的胞内多糖含量均高于对照组，即2,4-D对胞内多糖产量起促进作用。

3 结论与讨论

本试验将不同浓度生长素应用于蛹虫草的液体培养，考察其对蛹虫草有效成分累积的影响。试验结果表明，与对照组相比，当IBA的质量浓度为3 mg·L-1时，对蛹虫草生物量的促进效果最好。当NAA为1 mg·L-1时，生物量达到最大为16.20 g，比对照组提高了32.8%。2,4-D对生物量的累积起抑制作用。IBA和2,4-D对胞外多糖的累积均起抑制作用，NAA在低浓度时呈抑制作用，但当浓度为5 mg·L-1时，胞外多糖含量达到最大值85.60 mg，比对照组提高了80.3%。3种生长素对胞内多糖的累积均具促进作用。

本试验为蛹虫草大规模生产提供基础资料，同时对食用菌栽培中合理利用植物生长调节物质给予指导。

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Effect of Three Kinds of Auxin on the Liquid Fermentation of Cordyceps militaris

ZHENG Xin,TAO Chun-yu,XU Jia-lu,CHEN Yan-xu,XIE Kun-peng
(Liaoning Normal University,Dalian 116081,China)

Effect of different concentrations of three kinds of auxin (indole butyric acid(IBA),alpha naphthyl acetic acid(NAA)and 2,4-D)on liquid fermentation of Cordyceps militaris was studied.By detecting the biomass of C.militaris and the content of intracellular and extracellular polysaccharide under different concentrations,the optimum mass concentration of the three kinds of auxin was identified,and the growth of C.militaris under different concentrations was analyzed and discussed.The results showed that in terms of biomass,with a maximum 21.50 g when the mass concentration of IBA was 3 mg·L-1,which was 11.30%higher than the control group.Meanwhile the biomass reached the maximum 16.20 g when the mass concentration of NAA was 1 mg·L-1,which was 32.80%higher than the control group.In addition,2,4-D had an inhibitory effect on C.militaris biomass accumulation.In terms of extracellular polysaccharide,IBA and 2,4-D both had an inhibitory effect and NAA had an inhibitory effect when the mass concentration was 1 mg·L-1,but when the mass concentration was 5 mg·L-1,the accumulation of exopolysaccharide reached the maximum of 85.60 mg,which was 80.30%higher than the control group.In terms of intracellular polysaccharides,the three kinds of auxin played a promoting role.When adding NAA which the mass concentration was 1 mg·L-1,the accumulation of intracellular polysaccharide reached the maximum 117.93 mg,which was 275.36%higher than the control group.

auxin;Cordyceps militaris;liquid culture;Cordyceps polysaccharide

郑鑫（1995-），女，在读硕士研究生，主要研究方向为食用菌的液体培养。E-mail:15724590021＠163.com

*通信作者：谢鲲鹏（1976-），男，硕士，讲师，主要从事微生物及食用菌的教学和科研工作。E-mail:xkp_1995＠sina.com

2017-09-15

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0068-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.015