高纯橙皮素的制备及HPLC纯度分析

李珍柱,焦必宁,王 敏,周 剑,苏学素*

(1.西南大学 化学化工学院，重庆 400715；2.中国农业科学院/西南大学柑桔研究所，农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400712；3.中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

高纯橙皮素的制备及HPLC纯度分析

李珍柱1,焦必宁2*,王 敏3,周 剑3,苏学素1*

(1.西南大学 化学化工学院，重庆 400715；2.中国农业科学院/西南大学柑桔研究所，农业部柑桔产品质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆 400712；3.中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

建立了一种基于反相硅胶纯化的高纯橙皮素制备方法，充分优化了上样量、流速及洗脱液极性等因素，采用红外光谱法和核磁共振对纯化后产物进行定性分析，高效液相色谱法检测纯化前后橙皮素的纯度，最终产物的纯度达99.87%。该方法快速简便、制备量大、分离效率高，每天制备效率可达到克级，为制备橙皮素标准物质提供了技术支撑。

橙皮素；反相硅胶；纯化；定性分析；高效液相色谱

橙皮素(Hesperetin)是一种天然黄酮类化合物，属于二氢黄酮，是芸香科柑橘属植物果实的主要药效成分，具有抗氧化[1]、抗炎、抗肿瘤抗癌[2]、降血脂、抗病毒[3]等多种生理功能，广泛应用于食品保健药物及保健品和化妆品添加剂等领域。国内外对于橙皮素药物及其相关类黄酮活性物质在各种水果基质和药物中的分析检测及其生理功能的研究非常多，但是由于相关领域一直缺少纯度高的纯度标准物质或基体标准物质，导致不同国家、不同实验室及不同人员开展的相同测量内容的分析结果缺少可比性，因此迫切需要具有良好计量学特性的有证标准物质以甄别分析测量的可靠性和有效性。

标准物质[4-5]是指具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值[6]，用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物质[7-10]，可以直接将特性量值与国际基本单位(SI单位)联系，将测定结果直接溯源到SI 单位，对分析检测结果的可比性具有重要意义。研制橙皮素等类黄酮标准物质，不仅可应用于相关柑橘产品溯源与真实性检测，还可对添加有相关类黄酮活性物质的保健品、化妆品和医药产品的质量监控提供技术支撑。但标准物质的研制需要大量高纯原料进行均匀性及稳定性实验，要求纯度越高越好，原料纯度至少在99%以上。然而市售的原料及合成的原料很难达到此纯度，因此亟需一种可以快速简便制备大量高纯原料的方法。

目前制备高纯有机化合物的方法主要有制备型高效液相色谱法(PHPLC)[11-13]和柱层析法。制备型HPLC会消耗大量流动相，费时，上样量少，成本高。而反相硅胶[14]具有预处理简单、装柱方便、可重复利用及分离效率高的优点。反相硅胶的制备是以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团[15]，反相硅胶柱层析是指用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系[16]。因此本研究以橙皮素为原料，反相C18硅胶为柱层析填料，红外光谱法、核磁共振法及液质联用[17]为定性方法，采用高效液相色谱法检测纯度，通过单因素多水平试验考察了上样量、流速及洗脱液比例对于反相硅胶纯化橙皮素纯化效果的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

美国Waters系列HPLC色谱仪；紫外检测器；UMX2 型电子天平(分度值为0.1 μg，瑞士梅特勒公司)；Avance Ⅲ型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；NE-1101S旋转蒸发仪(日本东京理化Eyela公司)；202型电热恒温干燥箱(上海科恒公司)；液相色谱-飞行时间质谱联用仪Agilent 6545 Q-TOF LC/MS；DL 32型卡尔费休水分测定仪；DTG-60AH热重分析仪(日本岛津公司)。Shimadzu气相色谱仪(GC-2010)；Agilent 7500a电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国安捷伦公司)。

橙皮素原料(日本TCI公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国默克公司)；RP-C18硅胶(孔径：90 Å，美国Sigma公司)；乙酸(中国百灵威公司)；标准水样Apura-Water Standard，含水0.1%(美国默克公司)。

1.2 定性分析

对于所购原料，首先采用红外光谱法与核磁共振法(H谱)进行定性分析，确证原料是否为橙皮素物质。其中，红外光谱法采用溴化钾压片法，核磁共振法(H谱)是将样品溶于d6-DMSO溶剂中分析。对于纯化后产品，采用核磁共振法(H谱)和液相色谱-飞行时间质谱(LC-Q-TOF)两种方法鉴定纯化后产物的结构是否改变，进行定性确证。

1.3 橙皮素纯化实验

反相硅胶预处理及装柱：用甲醇浸泡150 g的C18反相硅胶，过夜，对其进行预处理。湿法装柱，装成内径为4 cm、高度为21 cm的反相硅胶柱，甲醇反复冲洗反相硅胶，加压除气泡，并用一定比例的流动相水-甲醇(30∶70)平衡柱子后上样。

样品纯化及收集：称取约500 mg的橙皮素原料，用少量甲醇溶解样品后，加水使之与甲醇比例为30∶70，混匀后用滴管上样，润洗2次，加流动相过柱，用20 mL玻璃管接溶液。薄层色谱法(TLC)点板，紫外灯下检测，将有荧光的玻璃管内溶液合并后旋蒸，收集样品并置于4 ℃冰箱中保存。上样结束后，用甲醇冲洗柱子，流动相平衡柱子后，可以继续上样，重复利用。

1.4 橙皮素纯度检测

1.4.1主成分含量检测称取纯化好的产物15 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解混匀并定容，配成300 mg/L的溶液。取1 mL该溶液于进样小瓶中，上机检测，比较主成分与杂质的含量比。色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流动相：0.2%乙酸水溶液-甲醇(45∶55)；检测波长：287 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

1.4.2水分测定开启卡尔费休库仑滴定仪，仪器自动滴定水分至终点，保持滴定池中没有水分。用微量注射器吸取40 μL标准水样，准确称量其质量，经垫片的针孔注入滴定池，输入质量进行滴定并校准。由于标定过程未进入空气，因此不需要扣除背景。称取5～7 mg的样品，迅速打开滴定池上塑胶盖，将样品加入反应瓶进行滴定，输入称量质量，待滴定结束，系统自动显示计算出的含水量，重复测定5次。为了消除空气中水分对测定结果的影响，模拟加样过程、质量及时间，但是不加样进行测定，计算空气中的水分空白值，扣除空白后得到最终结果。

1.4.3有机挥发性杂质测定采用顶空进样气相色谱法测定。气相色谱/氢火焰离子化检测器(GC/FID)仪器条件：色谱柱DB-624(0.32 mm ×1.8 μm，30 m)，载气：氢气流量：40 mL/min、空气流量：400 mL/min，检测器温度：260 ℃；程序升温条件：初始45 ℃保持5 min，以7 ℃/min的速率升温至60 ℃，再以15 ℃/min的速率升温至190 ℃。进样量：1 mL，分流比：5∶1。恒温炉温度：90 ℃；样品流路温度：115 ℃；传输线温度：120 ℃。

1.4.4非挥发性杂质的测定采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定非挥发性杂质的含量。ICP-MS仪器工作参数：射频功率1 450 W；等离子体气流速16 L/min；载气流速1.23 L/min；采样深度7.8 mm；蠕动泵转速0.3 r/s；雾化室温度2 ℃；同位素驻留时间0.1 s。

1.4.5除水实验将样品平铺在玻璃器皿中，设置烘箱温度100 ℃，烘干24 h 后，取出放入干燥器中，待温度降至室温时，再次测定水分。用烘箱烘干样品前，做热重分析(TGA)实验，防止样品烘干过程中分解变质。用烘箱烘至样品中水分不再变化时，再用冷冻干燥法除水，将样品放入-80 ℃冷冻0.5 h后进行冷冻干燥。

图1 橙皮素样品的红外谱图Fig.1 Infrared spectrum of hesperetin sample insert:standard infrared spectrum of hesperetin

图2 橙皮素样品的核磁氢谱Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectrum of hesperetin sample insert:standard nuclear magnetic resonance spectrum of hesperetin

2 结果与讨论

2.1 原料定性

2.2 高效液相色谱条件优化

紫外全扫描实验表明，橙皮素的最大吸收波长为287 nm。在此基础上，优化了SB-AQ、SB-C18及ODS-2 HYPERSIL 3种色谱柱，同时比较了甲醇和乙腈分别作为有机相时杂质的色谱出峰情况。在最优色谱柱和流动相的条件下，考察了流动相不同比例、梯度洗脱条件及不同波长下的色谱行为，最终确立的最优色谱条件如“1.4.1”所示。

结果表明，橙皮素纯度为98.66%，低于99%，主峰出峰时间为9 min，相对含量较大的两个杂质出峰时间为16 min和25 min，距离主峰较远，因此可以根据液相色谱分离的原理，以液相色谱优化的方法为基础，使用反相硅胶柱层析法除掉杂质以提高橙皮素的纯度。

2.3 反相硅胶纯化橙皮素条件优化

反相硅胶纯化结果的影响因素主要有硅胶柱的内径、上样量、流速及洗脱剂比例等，因此实验对比了不同内径的反相硅胶柱对纯化效率的影响，使用100 g反相硅胶，内径2 cm，柱高为28 cm的反相硅胶柱时最大流速太慢，上样量太少，上样200 mg即出现了严重拖尾现象。因此改用内径4 cm，150 g反相硅胶，装成柱高21 cm的反相硅胶柱，纯化速率提高了3倍，上样量明显提高。同时考察了上样量、流速及不同洗脱剂比例对回收率及产物纯度的影响。

2.3.1橙皮素上样量的优化实验考察了橙皮素上样量为100、300、500 mg时的纯化效率，如表1所示，样品上样量越多，回收率越高，产物的损失最少，上样量为500 mg时，产物回收率最高，但纯度开始降低，说明硅胶柱纯化过程中开始出现拖尾，为保证纯度，不再进行更高上样量的实验。最终选择500 mg为上样量。

表1 上样量因素考察Table 1 Effects of sample loading

2.3.2上柱流速的优化实验考察了不同流速对橙皮素纯化效率的影响。如表2所示，流速为15.5 mL/min时，产物回收率最高，产物纯度与其他条件所测纯度相差不大。继续增大流速时，回收率开始下降，考虑到后期要大量纯化样品，既需节约时间又需保证纯度，最终选择流速为15.5 mL/min。

表2 流速因素考察Table 2 Effects of flow rate

图3 纯化前后橙皮素及其杂质的色谱图对比Fig.3 Comparison of chromatograms of hesperetin and its impurities before and after purification

2.3.3洗脱剂极性的优化实验考察了洗脱剂极性对纯化效果的影响，结果显示，当水-甲醇的体积比为30∶70时，回收率最高，产物纯度也最高，15 min之后的杂质基本除去，3～4 min的杂质含量也有所降低；当水-甲醇的体积比为40∶60时，纯度最低，16 min和26 min的两个杂质含量很高，是影响橙皮素纯度的主要杂质，纯化效率最低，可能是因水相太高，导致上样的橙皮素溶解性太差，与反相硅胶并不能很好的吸附，从而影响产物纯度及回收率。当水-甲醇的体积比20∶80时，16 min处的杂质较高，可能是因为甲醇比例较高，流动相极性大，产物易从反相硅胶上洗脱，没有足够的时间吸附平衡，因此纯化效率和纯度降低。最终选择水-甲醇(30∶70)为洗脱剂。

反相硅胶最佳纯化条件确定为：反相硅胶用量150 g，上样量500 mg，洗脱剂水-甲醇(30∶70)，流速15.5 mL/min。图3为纯化前后橙皮素色谱图的对比图，可以看出3～4、16、25 min左右的杂质明显减少，纯化效果显著，纯化后橙皮素的纯度从98.66%提高到99.87%。

2.4 纯度分析

橙皮素热重分析实验如图4所示，曲线b代表程序升温过程中橙皮素质量的变化，橙皮素的质量在熔点(230～234 ℃)没有发生变化，表明橙皮素的热稳定性高，不易分解，因此可以采用烘干法去除橙皮素中的水分。实验过程中发现，单独使用烘箱干燥法和冷冻干燥法的除水效果均不理想，因此需结合这两种方法来达到除水目的。在100 ℃烘箱中烘干24 h后，水分由1.245 5%降至0.534 7%，继续烘干，水分没有明显降低，后续采用冷冻干燥法除水24 h，水分降至0.235 0%，继续使用冷冻干燥法除水24～48 h，水分没有明显变化。

图4 橙皮素的热重分析图Fig.4 Thermogravimetric analysis of hesperetin

图5 橙皮素纯化后样品的核磁氢谱Fig.5 H-NMR spectra of purified hesperetin

图6 橙皮素纯化后样品的质谱图Fig.6 Mass spectrum of purified hesperetin

同时采用ICP-MS测定了纯化后500 mg样品中的非挥发性杂质含量，结果为0.001 9%，含量较少，可忽略不计。采用顶空进样气相色谱法测定了55 mg样品中的挥发性杂质含量，主要溶剂残留有甲醇、丙酮和异丙醇，含量为0.181 1%。采用反相硅胶纯化的橙皮素在扣除水分和其他杂质后，纯度在99.4%以上，说明反相硅胶纯化橙皮素后纯度显著提高，此法是一种快速、简便和高效的纯化方法。

2.5 纯化后产物结构鉴定

最终产物通过核磁共振法和液相色谱-飞行时间质谱两种方法定性。图5为纯化除水后高纯橙皮素样品的核磁氢谱，与AIST标准谱库中核磁氢谱图中主要氢原子的化学位移值一致。采用液相色谱-飞行时间质谱进一步定性确认，图6为纯化后橙皮素的质谱图，分子离子峰[M+H]+的质荷比m/z为303.085 6，碎片离子m/z为153[1,3A0+H]+、177[1,4B0+H-H2]+、285[M+H-H2O]+，与文献[18]一致。因此可以确认纯化后橙皮素的结构未改变。

3 结 论

本文以红外光谱、核磁共振氢谱及液相色谱-飞行时间质谱为定性方法鉴定橙皮素的结构，HPLC检测纯化前后橙皮素的纯度，热重分析实验考察了橙皮素的热稳定性，烘箱-冷冻干燥法除水，卡尔费休水分滴定仪测定水分，采用反相硅胶纯化。纯化后橙皮素的纯度由98.66%提高到99.87%，该方法每天制备效率能达到克级，方法快速简便、制备量大，分离效率高，为制备高纯有机化合物及标准物质的深入研究提供了技术支撑。

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Preparation of Hesperetin Based on Reversed Phase Silica Gel Purification and Its Purity Analysis by HPLC

LI Zhen-zhu1,JIAO Bi-ning2*,WANG Min3,ZHOU Jian3,SU Xue-su1*

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Laboratory of Quality and Safty Risk Assessment for Citrus Products，Citrus Research Institute，Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China；3.Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agri-products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

In this study,a method for the preparation of high purity hesperetin based on reversed-phase silica gel purification was established.The factors such as loading volume,flow rate and eluent polarity were optimized.Structure of the product was identified by infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance,and the purity of the analyte was 99.87%.The daily preparation efficiency of the method could reach to gram-grade.With the advantages of high efficiency,large preparation and high separation efficiency,the method could provide a technical support for the preparation of certified reference material of hesperetin.

hesperetin; reverse phase silica gel; purification; qualitative analysis; high performance liquid chromatography

2017-07-11；

2017-10-17

国家现代农业(柑桔)产业技术体系建设专项(CARS-26)；国家重点研发专项(2016YFF0201105-2)；国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP2017004，GJFP2017015)

*

苏学素，副教授，研究方向：生物有机药物合成，E-mail：suxuesu@163.com

焦必宁，研究员，研究方向：果品质量安全与检测技术，E-mail：jiaobining@cric.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.014

O657.7

A

1004-4957(2017)12-1500-06