武夷茶中苯醚甲环唑的残留检测

李凌

福建林业职业技术学院,福建 南平 353000

中国是最早种植茶叶的国家[1]，茶叶不仅富含矿物质元素和蛋白质，而且还含有茶多糖以及茶多酚等功能性成分[2]。茶叶在生长过程中极易发生不同种类的病虫害，由这些病虫害引起的一系列问题会使得茶叶的品质下降，最终造成茶种植业严重亏损[3]。化学方法是目前我国对茶叶病虫害治理的主要手段，不仅对茶叶的品质造成了影响，还会对生态环境造成不可修复的损伤[4]。

我国检测茶叶农药残留的方法主要有气相色谱法（GC）、气象色谱质谱联用法（GC-MS）以及液相色谱质谱联用法（LC-MS）等[5]，这些化学分析方法在重复性以及灵敏度方面具有较大的优势，但设备造价昂贵，样品前处理要求较高等都是不可忽视的问题，这些缺点使得茶叶大规模检测变得较为困难。研究设计一种精密度好、准确度高的检测方法，对于茶叶的大规模检测有着深远的意义[6]。本文采用SERS技术快速分析茶叶中苯醚甲环唑农药残留并结合快速溶剂前处理的方法[7]。通过乙腈提取茶叶，利用变压吸附（PSA）和纳米竹炭（NBC）去除茶叶中的有机酸和生物碱等荧光物质。样本的基底采用OTR202金纳米颗粒作为增强物质，采集苯醚甲环唑以及乙腈溶液的表面增强拉曼光谱，并用SERS检测含苯醚甲环唑标准溶液的茶叶样本，检出农药残留样本的最低浓度，建立农药残留的预测模型并用偏最小二乘法进行数值计算，对测得的原始光谱进行预处理，并对理论值进行分析比对，最终得到了适合茶叶大规模检测的方法。

1 预测模型的建立

1.1 偏最小二乘法的数学模型

偏最小二乘法即PLS，是一种常用的多因子分析方法[8]。在利用偏最小二乘法进行数值计算时，通过交换因变量Y与自变量X的得分，使得被分析成分含量与主成分直接发生关联。

交互验证均方根误差即RMSECV，作为偏最小二乘法的评价指标，常被用来衡量方法的准确性。

RMSECV的计算公式如上所示，其中，n为样本总数，yi为第i个样本的实测值，为第i个样本的预测值。由公式可知，实测值与预测值的差值越小即得到的RMSECV计算值越小，最后的效果越好。

预测均方根误差即RMSEP，作为样本预测能力的评价标准，其数值大小与预测能力紧密相关，数值越大，预测能力越低。

上式为预测均方根误差的计算公式，其中，yi和^分别为集合中第i个样本的实测值与预测值。

相关系数r用于考察样本实测值与预测值之间的相关性，当预测值与实测值之间的相关性越好时，r值越接近1。

2 试验方法

2.1 实验材料与仪器

苯醚甲环唑标准品（99%，Stanford Chemical），乙酸乙酯（色谱纯，天津福晨化工公司），乙腈（色谱纯，百灵威科技有限公司），PSA（北京迪马科技有有限公司），纳米竹炭（100 nm，安吉沧海精细化工有限公司），OTR202和OTR103（Opto Trace Technologies），鲜茶叶和干茶叶均取自福建省武夷山市的武夷茶。

K-Sens-532高灵敏度激光拉曼光谱仪（上海复享光学有限公司），Agilent 7890A气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司），JOYN-DCY-24S型水浴吹氮仪（上海乔跃电子有限公司），STLH-32低速离心机（天津美特斯试验机厂）。

2.2 干茶叶样本制备

（1）将没有农药残留（阴性）的武夷茶干茶叶平均分成20份，每份重量保持在15 g左右。

（2）用色谱纯的乙腈将苯醚甲环唑的标准溶液稀释成20份不同浓度的溶液，每份溶液的体积为50 mL。浓度为0 mg/mL，编号为1；浓度为5 mg/mL，编号为2；浓度为10 mg/mL，编号为3；浓度范围15～27 mg/mL内间隔为3 mg/mL，编号为4～8；浓度范围28～31 mg/mL内间隔为1 mg/mL，编号为9～12；浓度范围32～42 mg/mL内间隔为2 mg/mL，编号为13～18；浓度45 mg/mL，编号为19，浓度55 mg/mL，编号为20。

（3）将配置好的溶液均匀喷洒到干茶叶上，得到20个样本，干燥后粉碎备用。

2.3 干茶叶样品前处理的优化

PSA用量优化：将含有苯醚甲环唑农残的茶叶提取液均分为3份，分别装到25 mg、50 mg、75 mg PSA的离心管中，剧烈振荡5 min后，以4500 r/min的转速离心20 min，将上清液过滤备用。

NBC用量优化：经苯醚甲环唑浸泡过的茶叶粉碎后取上层液，分别装到25 mg、30 mg、35 mg的离心管中，剧烈振荡5 min，以4500 r/min的转速离心20 min，取上层液，过滤待测。

2.4 光谱数据采集

拉曼光谱：功率250 mW，波长设置为780 nm，积分时间30 s，分辨率为5 cm-1，积分5次求平均值。

液样：样品池中分别加入0.5 mL的OTR202、0.05 mL待测样和0.5 mLOTR103并混合均匀，静置15 min后采集拉曼信号。

农药残留气质联用：OV-101毛细管柱，程序升温，柱子初温80℃，保持5 min，升温速率10℃/min，终温250℃，保持15 min；气化室温度260℃；载气为氦气，流速1.5 mL/min，进样量1 μL。

3 武夷茶中残留的苯醚甲环唑SERS检测

3.1 苯醚甲环唑的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱

由图1苯醚甲环唑标准溶液与乙腈溶液的SERS及普通拉曼光谱图可知，苯醚甲环唑与乙腈溶液的普通拉曼光谱图即b和d，在曲线走势及出峰位置上大致相同，说明信号峰并非农药残留产生。苯醚甲环唑标准溶液的SERS（a）在加入表面增强剂OTR202以及OTR103之后，信号得到增强，出现特征峰。而乙腈溶液的SERS(c)并没有出现特征峰。

图1 拉曼光谱图Fig.1 Raman spectrum

图2 不同浓度苯醚甲环唑溶液的SERS图Fig.2 SERS diagram of different difenoconazole concentrations

图2为经过预处理之后的不同浓度苯醚甲环唑溶液的SERS图，由上至下浓度分别为55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL，28 mg/mL，17 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，0 mg/mL。观察SERS信号可知，SERS信号强度的大小受溶液浓度大小的影响很明显，当溶液浓度变小时，SERS信号强度也变小，当溶液浓度为55 mg/mL，45 mg/mL，32 mg/mL时，曲线都出现几个明显的特征峰，当浓度降低时，特征峰已不再明显，当浓度大小为5 mg/mL时，特征峰已不再出现，由此可知，SERS能够检出苯醚甲环唑特征溶液的极限浓度为10 mg/mL。

3.2 试验条件的优化分析

不同的提取剂效果不同，在检测武夷茶中苯醚甲环唑含量时通常用到的提取剂有乙醚、乙腈以及二氯甲烷。乙醚和二氯甲烷在提取农残时会产生大量的共萃物，效果较差，而在使用乙腈作为提取剂时则不会出现这些情况。在使用SERS方法检测茶叶中苯醚甲环唑的含量时，由于苯醚甲环唑是弱极性物质，因此在提取时不需加水，防止茶叶中的水溶性物质析出。

图3 苯醚甲环唑提取液与标准溶液的SERS图Fig.3 SERS diagrams of difenoconazole extraction solution and standard solution

由图3苯醚甲环唑提取液SERS图以及苯醚甲环唑标准溶液SERS图可知，在苯醚甲环唑的提取液（a）中并未发现目标物质的信号峰，说明检测结果可能被茶叶中的荧光物质干扰，使得目标峰并未出现。PSA作为目前市场上使用较多的净化剂，具有较好的净化效果，能够将样品中的有机酸等物质有效的去除。在不同PSA用量下，苯醚甲环唑的拉曼特征峰并未出现，说明拉曼信号受到茶叶基质的干扰较大。随着PSA用量由25 mg一直升到75 mg时，谱图的基线逐渐趋于平稳，漂移现象减弱，当用量为75 mg时，其谱图与用量为50 mg时谱图基本一致，说明PSA的最佳用量为50 mg。

相比于普通竹炭，纳米竹炭具有多孔性等特性，吸附力较强且表面积更大。随着NBC用量的增加，基线漂移现象逐渐减弱，当用量为25 mg及30 mg时，并未出现苯醚甲环唑的拉曼信号峰，而用量为35 mg时出，出现了苯醚甲环唑的特征峰。结果表明，NBC的最佳用量为35 mg。

3.3 茶叶中苯醚甲环唑农药残留的SERS检测分析与预测

取经过处理过的茶叶样品净化液，放置到氮吹仪中经氮吹后用乙腈定容，定容完成后用气质联用仪进行真实值检测，如表1茶叶中苯醚甲环唑含量气质联用检测结果所示。

表1 茶叶中苯醚甲环唑含量气质联用检测结果Table 1 GC-MS test results of difenoconazole in tea

在对采集到的光谱数据进行分析时，首先采用MSC（多元散射校正）、SNV（标准正态变量变换）以及一阶二阶导数进行预处理，在对处理之后的数据建立偏最小二乘（PLS）模型。由表2不同预处理方法建立的PLS模型结果可知，经过MSC和SNV预处理后所建的模型优于一阶二阶导数，而一二阶导数处理后建立的模型又优于原始光谱，且SNV预处理方法效果较好。

表2 不同预处理方法建立的PLS模型结果Table 2 Results of PLS models built by different pretreatment methods

在验证方法的准确性时要对不同浓度的苯醚甲环唑茶叶样本进行检测，茶叶样本经前处理之后，采集三次拉曼信号并求得平均值，经SNV预处理后，采用PLS模型进行样本预测并与农药残留气质结果相比较，如图3预测值与真实值所示，发现茶叶样本中农药残留的预测回收率在90～105%之间，真实值与预测值误差在-10～5%之间，误差值在可允许的范围之内，与化学分析方法结果相差不大，说明茶叶中苯醚甲环唑的含量检测也可以通过该方法来完成。

表3 预测值和真实值Table 3 Predicted and true values

对样本进行t检验，得到的结果如表4预测值与参考值样本t检验结果所示，t取值为-0.435，取其绝对值发现远远小于t0.05,3=3.2565，则表明建立的方法可行，预测值与参考值之间相差不大。

表4 预测值与参考值样本t检验结果Table 4 Results of forecast and reference values t test

4 结论

本文利用表面增强拉曼光谱（SERS）技术，探究了苯醚甲环唑农药残留在武夷茶中含量的光谱检测方法。将苯醚甲环唑作为目标农药，将农药的标准溶液喷洒在茶叶样本上，分析苯醚甲环唑标准溶液SERS的拉曼光谱峰。以乙腈为提取剂，优化NBC和PSA的量，寻找到最佳的用量。以苯醚甲环唑作为目标物质采用偏最小二乘法建立武夷茶中农药残留的预测模型，模型预测回收率为92%～105%，相对误差最大值为5%，在允许的误差范围之内。最终的t检验结果表明利用偏最小二乘法建立的预测模型能够很好的预测目标农药的含量，与参考值之间的差值可忽略，满足大规模苯醚甲环唑农药残留的检测要求。对苯醚甲环唑标准溶液的最低检出浓度为10 mg/mL，农药残留量满足国家规定的残留限量(GB 2763-2014，10 mg/mL)要求。

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