表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突变检测及生物信息学分析

汤庄力 王 添 肖生祥 王晓鹏

表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突变检测及生物信息学分析

汤庄力 王 添 肖生祥 王晓鹏

目的检测表皮松解性掌跖角化病1家系KRT9基因突变情况并进行生物信息学分析。方法提取家系患者、正常人及100名健康志愿者外周血DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增KRT9基因全部外显子并测序。与数据库比对测序结果，运用生物信息学软件进行突变型蛋白质结构及功能预测分析。结果患者KRT9基因1号外显子内检测到一处c.487C>T错义突变(p.163R>W)，家族未患病成员以及100名正常对照中未发现突变。生物信息学分析提示该突变会导致蛋白质二级结构和理化性质改变，功能分析提示该突变会改变蛋白质生物功能。结论本家系检测到1个KRT9基因的热点突变，该突变对于疾病发生发展可能具有较大作用。

表皮松解性掌跖角化病； KRT9基因； 基因突变检测； 生物信息学分析

表皮松解性掌跖角化病(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK)是一组以掌跖部位角化过度为特点的常染色体显性遗传病。该病临床表现为掌跖部位弥漫性斑块状角质变厚，皮损表面光滑、色黄，呈蜡样改变，边缘清晰多呈红色。

1992年，Reis等[1]对1个EPPK大家系进行连锁遗传分析，将EPPK的致病基因定位于17q12-q21。而KRT9基因特异性表达于掌跖部位的表皮，被高度怀疑是EPPK的致病基因[2]。继而在1994年，Reis等[3]报道了第一例存在KRT9基因突变的EPPK病例，至此，该病分子遗传学机制日臻清晰。

截至当前，中英文文献中报道的EPPK突变位点已有30个，其中3个为无义突变，其余27个会改变蛋白质一级结构[4]。为了解本例患者的致病突变，运用PCR、一代测序技术检测该患者KRT9基因。

1 材料与方法

1.1 研究对象 先证者，男，20岁。父母非近亲婚配。出生后掌跖部位皮肤即粗糙增厚，可见弥漫性坚硬黄色斑块，带有光泽呈蜡样外观；两侧手掌及两侧跖部角化程度相近，可见明显皴裂。皮损边界清晰，呈淡红色(图1a，1b)。身体其他部位皮肤均正常，未见鱼鳞病样改变，皮肤附属器结构如甲、毛发等均正常。该家系共4代，所有患者均在出生1年内发病。

对先证者行皮肤活体组织病理检查示：表皮角化过度，颗粒层增厚，颗粒层及棘层内部可见较多裂隙，裂隙内可见大量淡染物质，可见表皮细胞松解。

1.2 标本收集 向患者家系中所有患者充分阐明本研究目的及意义，获取知情同意后分别采集家系中患者II1、II3、III4、III6、IV1、IV3外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，-80℃低温保存。家系中I1由于年长体弱未能来院采血。招募100名正常志愿者(入选条件：年龄不限，性别不限，非孕期，无系统性疾病)，同时采集患者家系中所有正常人外周血2 mL作为对照。家系血样按照系谱图(图1c)编号，正常对照的血样编号后在相同条件下贮存。

1.3 DNA提取 患者及正常人冻存血样标本置于室温完全熔化后，用全血基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技)提取基因组DNA备用，-20℃冻存。

1.4 PCR扩增外显子 采用Primer 3.0软件设计KRT9基因8个外显子的上下游引物。其中，1号外显子上游引物为5’-GGTGGTGGTTCTGGAGGTG-3’；下游引物为5’-TCCCTGGCTATTATCTGAGCTT-3’。扩增的各目标片段PCR产物长度约为400 bp。采用20 μL PCR反应体系，其中PCR mix 10 μL，DEPC H2O 5 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL。PCR扩增条件为：95℃预变性，5 min；35个扩增循环，每个循环由变性(94℃，30 s)、复性(56℃，30 s)、延伸(72℃，60 s)组成；最后72℃充分延伸5 min，4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳了解产物情况。

1.5 DNA序列测定与分析 PCR扩增产物纯化后，由ABI 3730XL型全自动荧光DNA测序仪(Applied Biosystems)测序。将测序结果与NCBI GeneBank数据库中人类KRT9基因进行比对，并分析单核苷酸多态性以及可能的致病突变。

1.6 生物信息学分析 运用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)对野生型及突变型KRT9蛋白的二级结构进行预测、比较，并重点运用PredcitProtein中COILS子程序分析基因突变对于卷曲螺旋的具体影响。同时对野生型KRT9蛋白进行功能注释、点突变预测以及基因本体(gene-ontology, GO)分析。运用SwissModel软件(https://www.swissmodel.expasy.org)对野生型及突变型KRT9蛋白的三级结构、四级结构进行预测、比较。

2 结果

2.1 PCR产物测序结果 本研究检测的患者基因组DNA经PCR、测序以及后期分析，所有患者的1号外显子均可检测到一处错义突变c.487C>T(图1d)，导致转录翻译的蛋白质163位精氨酸突变为色氨酸(p.163R>W)。100名正常对照组以及该患者家系中正常人基因检测均未见此错义突变。家系中患者其余外显子及内含子经比对未见突变。

查阅NCBI_SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)可排除该突变为人种特异性SNP，UniProt数据库(http://www.uniprot.org/uniprot/P35527)提示该位点为热点突变。

1a, 1b 先证者手掌及跖部皮损，增厚伴皴裂，色黄，呈蜡样光泽； 1c 家系图； 1d 家系患者基因测序结果，箭头所指为c.487C>T.

图1 先证者临床表现、家系图以及基因测序结果

2.2 生物信息学分析结果 野生型与突变型(p.163R>W)的KRT9蛋白的二级结构构型均为混合型，即无规则卷曲(irregular loops)占到全序列二级结构的50%以上，且α螺旋或β折叠均未占到45%以上。两者的α螺旋构成比相同，均为44.46%；然而突变型的β折叠构成比高达7.38%，远高于野生型的4.33%。

进一步分析野生型与突变型两者在各位点的构型情况，通过与已知的平行双股卷曲螺旋进行相似度分析，突变型卷曲螺旋片段长度缩短，突变位点的局部二级结构发生改变，片段前后的无规则卷曲片段长度对应增加，结构亦发生改变。

分析野生型及突变型的特殊二级结构以及理化性质，两者除溶解性发生改变外，二硫键的个数与分布、核仁组织区(nucleolar organizing regions, NORS)结构域位置、蛋白质等电点、跨膜位点及跨膜片段长度等均无明显差异。

SwissModel构建KRT9野生型及突变型的三维结构模型，两者的三级结构、四级结构模型相同，均在KRT9第222～456位氨基酸残基与已有数据库中KRT10最优匹配，所得模型空间构象见图2。模型的全局模型质量评价指数GMQE 0.12，定型模型能量分析 QMEAN-5.54。

图2 SwissModel预测的KRT9蛋白的空间构象

对KRT9进行功能注释以更深入了解功能层面的改变。运用PredictProtein软件点突变效应模块得到热图(图3)，直观表示在氨基酸序列各位点发生任何点突变对于蛋白质整体功能的可能影响。本文DNA测序所得基因突变转录翻译所得的氨基酸理论位点为163位，该位点发生R>W突变的预测评分为79分。

蓝色框代表放大展示的热图位于蛋白质序列的位置；横轴代表KRT9蛋白的氨基酸残基序列，星号指第163位氨基酸残基；纵轴代表20种氨基酸，箭头指本文中蛋白质突变产物色氨酸(W)；深绿色(分值<-50)强烈提示该突变对于蛋白质无影响，深红色(分值>50)强烈提示该突变对于蛋白质结构功能产生影响，白色(-50<分值<50)代表影响较弱；黑色代表该位点未突变；p.163R>W对于蛋白质的正常结构与功能产生强烈影响

图3 KRT9蛋白点突变热图

3 讨论

掌跖角化病是一类遗传性慢性皮肤病，临床表现多样，按照组织病理学可以分为较为多见的表皮松解性掌跖角化病(EPPK)以及相对少见的非表皮松解性掌跖角化病(non-epidermolytic palmoplantar keratoderma, NEPPK)。掌跖角化病临床表现为双侧掌跖部位弥漫性角质增厚，皮损境界清楚，边界多为淡红色斑；发病早，多为出生时即有或1岁内发病。部分文献报道，EPPK可合并非外力作用所致指节垫的发生，具体机制仍不明确[5-7]。

EPPK的发生与KRT9基因及其编码的角蛋白9有关。KRT9与角蛋白丝的组装相关，参与掌跖部位皮肤形成并维持掌跖部位的成熟皮肤结构[8]。对KRT9进行基因本体分析(Gene Ontology分析，GO分析)，该蛋白广泛分布于细胞器、中间丝细胞骨架等各细胞结构，与中间丝形成等细胞组成过程密切相关。

生物信息学分析结果显示，突变型KRT9蛋白的全局二级结构发生改变，β折叠比例显著高于野生型；此外，突变位点局部卷曲螺旋片段缩短，两端无规则卷曲片段长度增加，导致蛋白质局部二级结构改变。

蛋白质二级结构的改变会影响三级乃至四级结构并进而造成功能的改变，本研究运用SwissModel软件预测KRT9蛋白及其突变型的三级、四级结构，以期直观了解该突变对于蛋白质最终结构的影响。虽然该软件算法基于当前最完备、最高效的同源匹配模型构建，但该算法需要根据部分蛋白质已有的空间构象数据库来匹配预测未知蛋白质或氨基酸，而现阶段该数据库容量有限，因此软件所建立模型对于发生于非同源匹配区域的突变可能欠敏感，预测结果也可能存在偏颇。随着日后算法的不断完善以及对蛋白质空间结构研究的不断深入，日后运用空间建模了解基因突变对蛋白质的影响将日臻成熟、便利。

就蛋白质理化性质而言，KRT9蛋白p.163R>W造成突变型的溶解度发生改变，而在前文预测到的诸如二硫键等在突变型与野生型无明显差异，提示突变型可能通过未作预测的其他分子间相互作用，诸如氢键、盐键或范德华力等对于全局结构造成了影响，下一步可着眼上述分子间作用力，以更好揭示其在蛋白质结构、功能及理化性质中的作用。

功能层面所进行的点突变分析结果可知，p.163R>W得分79，该数值越接近100提示发生在该位点的点突变对于蛋白质的影响越大。Kobayashi曾构建同一位点另一热点突变p.163R>Q的体外表达载体，皮下注射入无毛非孕期大鼠后会出现EPPK类似的临床表现，进而验证p.163R>Q为致病突变[9]；而运用点突变分析所得p.163R>Q评分为59分，低于文中所述突变的评分，高度提示p.163R>W 为致病突变。

遗传性疾病的热点突变被广泛用于产前筛查以提高新生人口质量[10,11]。此外，对于热点突变的生物信息学分析有助于我们更好地理解热点突变在疾病发生发展中扮演的角色和作用，对于更加透彻地认识疾病、攻克疾病具有重大意义。

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GenemutationdetectionandbioinformaticalanalysisofKeratin9-geneinonepedigreeofepidermolyticpalmoplantarkeratoderma

TANGZhuangli,WANGTian,XIAOShengxiang,WANGXiaopeng.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710004,China

s:XIAOShengxiang,E-mail：xiao_sx@163.com

WANGXiaopeng,E-mail：wangdctor@163.com

Objective: To detect the mutations and perform bioinformatical analysis of KRT9 gene in a pedigree with epidermolytic palmoplantar keratoderma.MethodsGenomic DNA was abstracted from peripheral blood of all patients, normal persons in the pedigree and 100 unrelated healthy controls. All exons of KRT9 gene were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the products were sequenced subsequently. The PCR results were compared with the database. Structural and functional analysis were performed via bioinformatical software.ResultsOne hot-spot missense mutation c.487C>T was identified in Exon 1 of KRT9, which was not detected in normal persons in the pedigree and healthy controls. Bioinformatical analyses indicated the mutation changed the global secondary structure and physicochemical property. Functional annotation revealed a probable negative influence on the biological function of KRT9 protein.ConclusionOne hot-spot mutation is identified, which may play a role in the pathogenesis of epidermolytic palmoplantar keratoderma.

epidermolytic palmoplantar keratoderma; KRT9 gene; gene mutation detection; bioinformatical analysis

(收稿：2017-08-08 修回：2017-08-30)