健骨IV号对骨组织修复相关因子的调控作用

段佩玲，夏河山

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 451460)

健骨IV号对骨组织修复相关因子的调控作用

段佩玲，夏河山

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 451460)

目的：明确专利药物健骨Ⅳ号对骨组织修复相关因子的调控作用。方法：液氮冷冻成功建造30个大鼠股骨头坏死模型，将它们随机分成3组,即正常手术组、模型组、加药组。定期对各组大鼠进行X线片观察；手术4周后分别提取总RNA,进行成骨转化因子Cbfa1、OSX两对基因的PCR(聚合酶链式反应)扩增。结果：加药组在X线片和Cbfa1、OSX两对成骨调控因子mRNA表达等改变均较正常手术组和模型组明显。结论：从骨质生成的角度明确健骨Ⅳ号对成骨转化因子的调控作用，为健骨Ⅳ号治疗股骨头坏死的临床应用提供理论依据。

健骨IV号；Cbfa1；OSX；骨组织；修复

股骨头坏死，又称股骨头缺血性坏死，为常见的骨关节病之一，大多因风湿病、血液病、潜水病、烧伤等疾患引起，先破坏邻近关节面组织的血液供应，进而造成坏死。近年来，随着生活方式的改变以及外伤、饮酒、激素类药物大量应用等原因，发病率呈上升趋势。现在治疗股骨头坏死的方法越来越多，传统的物理疗法和组织工程新技术各有利弊。相对各种保髋手术和关节置换术等方法，中药通过活血化瘀、益气通络重建血供、促进骨的修复等方面具有不可取代的优势。中药治疗股骨头坏死主要是通过调节全身气血运行、补益肝肾，达到祛瘀生新、修复坏死的目的。

在骨科疾病的治疗上，骨的修复与功能重建是判断疗效的关键指标之一。已有研究表明：Cbfa1和其下游OSX基因是骨矿化的重要转录因子，具有明确的诱导成骨细胞分化和成骨效应。Cbfa1的超表达可以使成骨细胞和非成骨细胞系的骨钙素表达上调，Cbfa1基因的表达可以作为检验成骨细胞分化的标志。OSX是一种具有锌指基序结构域、成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的转录因子。OSX可能是Cbfa1的下游基因,在OSX基因敲除小鼠与 Cbfa1基因敲除小鼠的表现型相似, 膜内成骨及软骨内成骨过程均受阻。本研究采用动物实验模型观察专利药物健骨Ⅳ号对骨组织中Cbfa1和OSX成骨转录因子的影响，明确健骨Ⅳ号对成骨转化因子的调控作用，为健骨Ⅳ号治疗股骨头坏死的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠30只[购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2005-0001]，雌雄各半，体重200±20g。随机分成3组：A组为正常手术组，B组为模型组，C组为加药组。

1.2 主要实验仪器与试剂

实验仪器：BIO IMAGING SYSTEM凝胶成像系统，OMNI TH组织均质仪，低温离心机(Centri￣fuge5415R)头端打磨光滑的钢丝(直径约3mm)1根，液氮罐。

试剂：Trizol(14111)InvitrogenCorporationTa酶(CW0608)，dNTPsigmaRNA反转录试剂盒(HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒v04082010-2.1)，琼脂糖(Agarose)(1103733)，Basingstoke,Ham￣pshire,England，2xTaq MasterMix(含染料04022010-2.1)，6×buffar(RD101-01)，Marker(D526A v2010.02)，溴化乙啶(EB)(1239-45-8Sigma)，络合碘消毒液(有效碘含量为4500～5500 mg/L)，注射用青霉素钠针，0.9%生理盐水，医用10%水合氯醛，10%二乙胺四乙酸钠(Sigma)，多聚甲醛(自配)，石蜡等。

1.3 模型建造

大鼠→1%戊巴比妥钠麻醉→股骨外侧入路,切开皮肤皮下组织(均采用左侧造模)→暴露股骨头，保护周围组织→快速液氮(-80℃)冷冻，20s/次，10次→温生理盐水复温→明胶封口，逐层缝合→分组实验→观察4周内的变化(1周、2周、3周、4周)。

C组大鼠每日按40 mg/kg注射健骨Ⅳ号，均为左髋部肌肉注射。

2周后拍摄X线片可见软骨下“新月征”，4周后可观察到股骨头关节面现明显皱缩，有股骨头碎裂及髓关节脱位现象。

1.4 骨RNA提取

1.5 cDNA反转录步骤：

总体积为20 ul。RT Mix5x为4 ul，Primer Mix为2 ul，RNA Template为xul，HiNi-MMLV Mix为1 ul， Nase-Free water为yul。震荡混匀，短暂离心。反应条件：①37℃，40 min；②70℃,10 min。反应结束短暂离心，反转录产物-20℃以下长期保存。

1.6 PCR反应

扩增体系50 ul。ddH2O为36 ul，Taq酶(5 U/μl)为1 ul，10Xbuffer为5 ul，dNTP(10mM)为1 ul，Mg2+(2.5 mM)为3 ul，引物(10um)为各1 ul 共2 ul，2 ul cDNA模板。

PCR引物及反应条件见表1。

表1 PCR引物及反应条件

1.7 电泳分析

灰度扫描后，软件分析测定其光密度。

净密度值=(平均密度-背景密度)×面积

1.8 统计学处理

2 结果与讨论

2.1 X线光片观察

分别于术后第1周、第2周、第3周、第4周用医用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g剂量腹腔内注射麻醉后，采用钼靶X线机拍自然位X线片(参数：24 kV,40 mA)，了解股骨头骨质情况及关节面情况。15天后对X线光片进行观察，各组均出现新月征，以此确定模型成功。4周后观察模型对照组左侧股骨头软骨下骨纹理越发稀疏，坏死更为明显。药物组有6只大鼠骨纹理明显增多，新月征范围明显减少。与模型组比较，药物组股骨头坏死程度较轻,说明健骨Ⅳ号有助于股骨头坏死部位的修复。

2.2 Cbfa1和OSX

分别对3组大鼠的Cbfa1和OSX进行检测、对比，加药组的两对基因mRNA表达与正常组、模型组比较均有明显提高(P<0.05)，28天的检测结果见表2。

表2 RT-PCR检测细胞四组基因的mRNA表达(n=6)

SampleCbfa1OSXHIF-1αVEGF正常手术组1.22±0.441.30±0.561.08±0.211.16±0.6模型组2.56±1.06*2.81±1.44*1.34±0.651.67±0.81加药组4.08±1.23*4.22±1.57*3.78±1.23*3.62±1.53*

注：*P<0.05正常对照组

3 讨论

在中医药治疗股骨头坏死的中药组方上常选用活血化瘀、补肝肾、强筋骨为主的药物，如丹参、当归、川芍等。现代药理学研究证实，这些药物多具有改善局部血液循环、增加血容量、改善微循环的作用，其中有些还有增加细胞对缺氧的耐受性，提高超氧化物歧化酶的活性，调节成骨相关因子的作用。中医药治疗大多无创伤、毒副作用少，能够有效地减轻患者疼痛症状、阻断病程进一步发展。因为中药成分复杂、生物利用度低、起效慢等，所以影响了其疗效的评价和进一步的机制研究。

本研究依据我国传统医学，探索研究国家发明专利中药药物健骨Ⅳ号对成骨分化相关因子Cbfa1、OSX的调控作用。实验证实健骨Ⅳ号能提高Cbfa1、OSX两对成骨调控因子mRNA表达量，在一定程度上改善了股骨头的血供。这与健骨Ⅳ号“活血”“补肾”的客观实质相互关联。在细胞-分子水平明确了成骨分化与血管生成之间调控基因的相关性，为“祛瘀生新，填精生髓”提供了客观 依据，丰富了股骨头坏死的“血瘀论”，最大限度地发挥了中医药在股骨头坏死治疗中的作用。后续实验将进一步明确健骨Ⅳ号的作用机制，为寻找安全、高效、低廉与康复期短的股骨头坏死治疗新药物提供理论依据。

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RegulationofJianguNo.ⅣRelatedFactorofBoneTissueRepair

DUAN Peiling, XIA Heshan

(Zhengzhou Railway Vocational and Technical College, Zhengzhou 451460, China)

Objective: To define the regulation of the specific patent medicine Jiangu No. IV to factors of bone tissue repair. Method: Built rat models of femoral head necrosis successfully by liquid nitrogen refrigeration. They were randomly divided into 3 groups: normal operation group, model group, operation of drug group. Observed them regularly by X-ray film. 4 weeks later, extracted total RNA respectively from the bone tissue of femoral head for PCR amplification of the osteoblast conversion factors Cbfa1and OSX. Results: mRNA expression of Cbfa1 and OSX in operation of drug group increase obviously. Conclusion：The regulation of Jiangu No. IV on osteoblast conversion factors was clear and definite from the angle of bone formation. That would provide theoretical basis for the clinical application of Jiangu No. IV.

Jiangu No.Ⅳ; Cbfa1; OSX

2017 - 06- 24

河南省科学技术厅科技攻关项目(102102210088)

段佩玲(1972—)，女，河南郑州人，郑州铁路职业技术学院讲师，硕士，研究方向为分子生物学。

R96

A

1008-6811(2017)03-0023-03

方 艳]