游泳训练对新生大鼠学习记忆和海马神经发生的影响

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(1.湖南省娄底市娄星区人民医院,湖南 娄底 417000； 2.湖南省中医药高等专科学校,湖南 株洲 412000)

·基础医学·

游泳训练对新生大鼠学习记忆和海马神经发生的影响

刘鹏英1,张春花1,陈歆2,贺军民1*

(1.湖南省娄底市娄星区人民医院,湖南 娄底 417000； 2.湖南省中医药高等专科学校,湖南 株洲 412000)

目的观察游泳训练对新生大鼠学习记忆和海马神经发生的影响。方法雄性7日龄新生SD大鼠随机分为对照和游泳训练组。训练组大鼠出生后第11天进行无负重游泳训练3周。Morris水迷宫法检测学习记忆能力,BrdU+/NeuN+免疫荧光双标染色分析海马神经发生,Western blot检测海马脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达。结果对照和游泳训练组大鼠随着训练天数增加,寻找平台潜伏期均明显缩短(均P<0.05)；定位航行实验的第二、三和四天,游泳训练组大鼠寻找平台潜伏期较对照组均显著减小(均P<0.05)。游泳训练组大鼠穿越目标次数何时间明显增加(均P<0.05)。与对照相比,游泳训练组大鼠海马齿状回NeuN+/BrdU+阳性数量显著增加(P<0.05),BDNF表达显著增加(P<0.05)。结论游泳训练提高了新生大鼠的学习记忆能力,其机制可能与游泳训练显著上调大鼠海马BDNF的表达促进海马神经发生有关。

新生大鼠； 游泳训练； 学习记忆； 海马； 神经发生； 脑源性神经营养因子

研究发现运动能促进学习记忆等认知功能和个性发展,增强体魄,保障身体健康,还能促进心理健康,也能降低以认知功能障碍为特征的阿尔默海茨病等神经系统疾病的发病风险[1]。海马是参与学习记忆的重要脑区,研究表明运动能上调大鼠海马组织中c-fos和c-jun等即刻早期基因的表达,促进与学习记忆密切相关脑区神经元的增殖和分化,诱导长时程增强,增加学习和记忆能力[2-3]。海马齿状回的颗粒细胞亚层是神经干细胞的聚集区,能够不断产生新的颗粒细胞,这些新生的细胞能不断的分化、迁移,最终发育为新的、完整的神经细胞,这个过程称为海马神经发生[4-5]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在神经元生长发育过程中发挥了关键作用,特别是在与学习记忆有关的海马中,参与了海马神经发生的调控[6-7]。婴幼儿时期是学习和记忆功能发育的重要时期,研究显示早期的强度过大、时间过长的不良刺激,如：麻醉、慢性疼痛等可抑制学习和记忆功能的发育,对学习记忆功能产生不良影响[8]。早期的适宜刺激可增加海马的突触密度,增强学习记忆功能的发育。因此本研究旨在探讨游泳训练对新生大鼠学习和记忆功能的影响,并从BDNF信号通路和海马神经发生的角度初步探索其机制。

1 材料与方法

1.1材料改良型Morris水迷宫实验装置(成都泰盟科技有限公司)。BrdU(美国Sigma公司),BrdU一抗(美国Accurate Chemical Westbury公司)和神经元标记物NeuN一抗(美国Millipore公司)。BCA蛋白定量试剂(美国Invitrogen公司)。兔抗大鼠BDNF和β-actin抗和辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Santa Cruz公司)。

1.2实验方法

1.2.1 实验动物与分组 实验中共使用SPF级6窝SD新生大鼠,每窝6～10只大鼠,共81只7日龄新生大鼠和10只孕鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供)。孕鼠常规分笼饲养,每笼1只,孕鼠自然分娩。选择36只健康雄性新生SD大鼠用于后续实验。在哺乳期间母鼠与新生SD大鼠同笼饲养,采用母乳喂养。饲养室温为22 ℃,相对湿度为55%,12 h光照,自由进食和饮水。根据随机区组化实验设计的原则,将入选的健康雄性新生SD大鼠随机分为对照组和游泳训练组(n=18)。

1.2.2 游泳训练 进行游泳训练的圆形水池高30 cm,直径是50 cm,水面距离圆形水池上缘20 cm,水温维持在24～26 ℃。7日龄的新生大鼠从出生后第8天开始进行3次适应性游泳训练,每次30 min,每天1次,共进行3天。随后从出生后第11天进行无负重游泳训练,每次60 min,每天1次,共进行3周。3周的游泳训练结束后将每组大鼠随机地分为三个亚组(n=6),一个亚组大鼠用于行为学检测,一个亚组大鼠用于BrdU注射和免疫荧光双标记染色实验,余下的大鼠用于Western blot分析。

1.2.3 Morris水迷宫测试 3周的游泳训练结束后,进行Morris水迷宫测试。大鼠先熟悉实验环境3天后,然后依次进行定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时4天,每天上午每只大鼠训练4次,每次训练采用不同象限入水,在大鼠放入水池时,都使大鼠面向池壁,同一次训练所有大鼠从相同的象限入水。每次训练60 s,大鼠如在60 s内找到平台并停留3 s,则训练结束,记录其找到平台的时间为潜伏期。如果大鼠在60 s内没有找到平台,则人为的把大鼠引到平台上,则其找到平台的潜伏期为60 s。大鼠在每次爬到平台上或被引到平台上后,在平台上停留休息15 s,实验共进行4次。空间探索实验在大鼠的最后一次定位航行实验结束后的24 h进行,撤去平台,选择第三象限作为下水点,记录大鼠60 s内穿越平台区域次数,记为穿越目标次数；记录大鼠60 s内穿越平台区域的时间,记为穿越目标时间。

1.2.4 BrdU注射和免疫荧光双标记染色 从游泳训练开始的第1天,所有大鼠通过腹腔注射BrdU(50 mg/kg体重),每天1次,连续进行10天。3周的游泳训练结束后,2%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠,打开大鼠的胸腔,暴露心脏,剪开左心耳,从左心尖处插入灌流针,灌注0.1 mol/L PBS。将血液冲洗干净后,再用4%多聚甲醛继续灌注。打开颅脑骨,取出脑组织,在4%多聚甲醛中固定24 h,然后放置在30%蔗糖溶液中,4 ℃条件下保存。当大鼠的脑组织沉到瓶底后,进行冰冻切片,切片厚度为40 μm。

每只大鼠在海马部位每6张脑切片选取第1张切片,切片选取好后,用HCl溶液(2 mmol/L)在37 ℃下处理30 min,PBS液清洗,在封闭液中室温下孵育1 h。加入兔抗BrdU(1∶400)和山羊抗NeuN(1∶200),4 ℃孵育过夜。第2天用PBS清洗后,加入Alexa Fluor488(NeuN)和Alexa Fluor 594(BrdU)荧光染料标记的相应二抗(1∶200),室温下避光孵育2 h,PBS清洗、封片,在奥林巴斯共聚焦显微镜下观察颗粒细胞层。在荧光显微镜下,BrdU+细胞呈现红色颗粒状荧光。NeuN+细胞呈现绿色颗粒状荧光。BrdU+/NeuN+共同标记细胞呈现黄色颗粒状荧光。计算海马DG区BrdU+/NeuN+荧光双标阳性细胞占BrdU+阳性细胞总数的百分率(%)。

1.2.5 Western blot分析 3周的游泳训练结束后,2%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠,打开大鼠的胸腔,暴露心脏,心脏放血处死大鼠,打开颅脑骨,取出脑组织。按试剂盒说明提取脑组织总蛋白,取适量蛋白样本煮沸10 min变性蛋白。取蛋白样品10 μL,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。通过电转移将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜,4%脱脂牛奶孵育聚偏氟乙烯膜2 h以封闭非特异性抗原。加入兔抗大鼠BDNF和β-actin的一抗,4℃下孵育过夜。洗膜3次,加入二抗,4℃下继续孵育4 h。ECL试剂显影在胶片上,凝胶图像分析系统扫描胶片并分析处理结果。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS17 0统计软件分析,实验数据以均数±标准差表示,两组间差异比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1游泳训练对新生大鼠学习记忆能力的影响采用Morris水迷宫实验观察游泳训练对新生大鼠学习记忆能力的影响。结果如表1所示：对照组和游泳训练组大鼠随着训练天数增加,寻找平台的潜伏期均明显缩短(均P<0.05)；在定位航行实验的第二、三和四天,游泳训练组大鼠的寻找平台潜伏期与对照组比较均显著减小(均P<0.05)。空间探索实验中,游泳训练组大鼠穿越目标次数明显增加(P<0.05),穿越目标时间明显延长(P<0.05)。

与对照组比较，a:P<0.05,n=14

2.2游泳训练对新生大鼠海马齿状回神经发生的影响BrdU可以标记新生的细胞,而NeuN是成熟神经元核内标记物,双标阳性的细胞为新生的成熟颗粒细胞。结果如图1所示：与对照组相比,游泳训练组的大鼠海马齿状回NeuN+/BrdU+阳性数量显著增加(P<0.05),表明游泳训练促进了新生大鼠海马新生细胞的增殖和神经元的分化。

2.3游泳训练对新生大鼠海马BDNF表达的影响结果如图2所示：与对照组相比,游泳训练组的大鼠海马BDNF表达水平显著性增加(P<0.05)。

3 讨 论

婴幼儿时期是人和动物学习和记忆功能发育的关键时期。刚出生的大鼠在年龄上相当于人类的孕期为28周的胎儿,出生7 天的大鼠相当于人类的孕期为36周的胎儿,出生21 天的大鼠相当于人类1～2岁的幼儿[9]。本研究中选择出生7 天的新生大鼠作为研究对象,相当于人类的早产儿的婴儿时期,通过给予大鼠持续3周的游泳训练,观察游泳训练对新生大鼠学习记忆能力的影响。本研究结果显示游泳训练明显增强了新生大鼠的学习和记忆能力,表现为在定位航行实验的第二、三和四天,游泳训练组大鼠的寻找平台潜伏期与对照组比较均显著减小。游泳训练组大鼠穿越目标次数明显增加,穿越目标时间明显延长。

图2 游泳训练对新生大鼠海马BDNF表达的影响与对照组比较,*P<0.05。

Morris水迷宫实验是检测鼠类动物的空间学习和记忆的形成和维持时间的常用行为学检测方法[10]。Morris水迷宫实验中的定位航行实验可以检测鼠类对空间记忆的获得能力,找到平台的潜伏期越长提示动物习得能力越低。Morris水迷宫实验中的空间探索实验可以检测鼠类对记忆的保持能力,动物穿越目标次数减少和穿越目标时间缩短表明记忆保持能力降低[11]。本研究结果表明与对照组比较游泳训练组的新生大鼠的空间记忆的习得能力和记忆保持能力均明显增加,早期的游泳训练能改善幼鼠的学习记忆能力。

认知功能是指大脑对信息的获取、储存、加工和提取的能力,也就是对事物的构成、事物的性能、该事物与他物的关系、事物的发展动力和方向及基本规律的把握能力。认知功能包括学习、记忆、语言、执行、计算和判断等。研究表明与空间学习和记忆等认知功能关系最密切的脑区是海马,海马的齿状回的颗粒下区有大量的祖细胞,这些具有增殖和分化成为成熟神经细胞的潜能,称为海马神经发生[12]。新生的神经细胞的形态和功能特征与成熟颗粒细胞基本相同,他们能与分子层及多形层细胞形成突触联系,参与到海马功能的神经环路中,参与海马的功能活动,而海马神经发生的减少可导致学习记忆障碍。BDNF是神经营养素家族的主要成员,具有调节中枢突触形成和可塑性,促进神经元存活,促进神经元的修复及结构重建和调节神经递质的释放等作用。BDNF在海马神经发生及学习和记忆过程中发挥着重要作用[13]。研究发现BDNF基因在与学习记忆相关脑区的表达增加可增强大鼠的空间学习和记忆能力[14]。情景学习的过程是海马依赖的,可选择性上调大鼠海马CA1区BDNF的表达。长时程增强(longterm potentiation,LTP)是学习记忆的重要神经基础,敲除BDNF基因可抑制LTP,而补充BDNF可逆转这种作用[15-16]。本研究的结果显示游泳训练显著上调了大鼠海马组织中BDNF的表达,显著增加了NeuN+/BrdU+阳性数量,这些结果提示游泳训练可增加BDNF的分泌,促进海马神经发生。

总之，本实验结果阐明游泳训练提高了新生大鼠的学习记忆能力,其机制可能与游泳训练显著上调了大鼠海马BDNF的表达促进海马神经发生有关。因此对新出生的婴儿进行游泳训练可增强海马神经发生,提高空间学习记忆能力。

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Effectsofswimmingtrainingonthelearningandmemoryandhippocampusneurogenesisinnewbornrats

LIU Pengying,ZHANG Chunhua,CHEN Xin,et al

(People’sHospitalofLouxingDistrict,Loudi417000,Hunan,China)

ObjectiveTo observe effect of swimming training on learning and memory and hippocampus neurogenesis in neonatal rats.Methods7-days-old newborn Sprague-Dawley rats were randomly divided into control and swimming training group.From eleventh days after birth,the rats in swimming group were carried on 3-weeks swimming training with no load once a day,60 min every time.Learning and memory was evaluated by Morris water maze.The number of BrdU+/NeuN+was counted by immunofluorescence double labeling staining.The expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) was tested by Western blot.ResultsThe latency for finding the hidden platform in control and swimming training group was obviously decreased with the training days increasing (allP<0.05).On the second,third and forth day,the latency for finding the hidden platform in swimming training group was significantly decreased compared with control (allP<0.05).Number across platform and the time across platform was significantly increased in swimming training group compared with control (allP<0.05).Number of NeuN+/BrdU+cells was significantly increased and expression of BDNF was significantly increased in swimming training group compared with control (allP<0.05).ConclusionSwimming training increases capacity of learning and memory in neonatal rats,which mechanism may be related with up-regulation of BDNF expression and increase of neurogenesis in hippocampus of rats.

newborn rats; swimming training; hippocampus; neurogenesis; brain derived neurotrophic factor

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.009

2016-10-31；

2017-01-08

*通讯作者,E-mail:904383407@qq.com.

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