野菊花抗肿瘤活性部位筛选研究

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(1.南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001；2.湖南省分子靶标新药研究协同创新中心)

·基础医学·

野菊花抗肿瘤活性部位筛选研究

全文婕1,史晓欣1,2,熊润德1,张开2,喻翠云1,2,贺冬秀1,2*

(1.南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001；2.湖南省分子靶标新药研究协同创新中心)

目的筛选野菊花的抗肿瘤活性部位并初步探讨其机制。方法利用形态观察、CCK-8、Hoechst染色和划痕实验评价野菊花总提取物(CIE)及其石油醚部位(PEE)、乙酸乙酯部位(EAE)、正丁醇部位提取物(NAE)对人肺癌细胞A549、人慢性骨髓性白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG2的抗肿瘤活性。结果CIE及PEE、EAE、NAE>150 μg/mL对A549、K562和MCF-7细胞形态影响明显且CIE及PEE、EAE、NAE(150～250 μg/mL)对上述三种细胞增殖抑制作用呈量效相关性，PEE对MCF-7细胞抑制效果最显著；EAE对MCF-7细胞的诱导凋亡作用和迁移抑制作用相对较好。结论野菊花具有抗肿瘤活性，抗肿瘤活性较强的部位为石油醚和乙酸乙酯部位，其抗肿瘤机制可能与抑制细胞增殖、迁移和诱导细胞凋亡有关，这为进一步研究开发野菊花提供基础。

野菊花； 肿瘤细胞； 抗肿瘤活性； 抗肿瘤活性部位

野菊花为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥头状花序，别名为野黄菊花、苦薏、山菊花、甘菊花。中国药典记载，野菊花性苦、辛、微寒，具有清热解毒，泻火平肝之功效。有学者认为在中医辨证论治的指导下，野菊花可用于治疗热毒内盛所致的胰腺癌、鼻咽癌、肝癌、淋巴瘤和肺癌等[1]。现代药理学研究证实，野菊花具有广谱抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老和增强免疫等多种药理活性[2-3]，有良好的临床应用价值和研发潜力。国内研究发现，野菊花提取物能抑制髓原白血病细胞HL60和成骨肉瘤Saos-2等细胞增殖[4-5]，同时可联合顺铂诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡[6]。近年研究还发现，野菊花不同极性部位提取物的药理活性不同[7-8]。有关野菊花抗肿瘤作用报道少，对野菊花抗肿瘤活性部位的筛选也鲜有研究。因此，本文通过形态观察法、CCK-8法、Hoechst染色和划痕实验评价野菊花不同极性部位提取物对人肺癌细胞株A549、人慢性骨髓性白血病细胞株K562、人乳腺癌细胞株MCF-7和人肝癌细胞株HepG2的抗肿瘤活性，并筛选出野菊花的最佳抗肿瘤活性部位，为进一步开发野菊花奠定基础。

1 材料与方法

1.1药材与试剂野菊花购自湖南省长沙市药材公司；Gibco DMEM培养基购自美国Thermo Fisher科技公司；胎牛血清(FBS)、胰酶细胞消化液、青链霉素双抗和CCK-8 试剂盒均购自浙江天杭生物公司；MTT购自美国Amresco生物公司；Hoechst 33342 染色试剂盒购于万类生物科技公司；其它实验试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1 野菊花总提取物(chrysanthemum indicum extract，CIE)、石油醚部位 (Petroleum ether extract，PEE)、乙酸乙酯部位(Ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇部位提取物(N-butyl alcohol extract，NAE) 的制备 野菊花干燥，粉碎成粉，过40目药筛。野菊花粉先以15倍量的70%乙醇浸泡65 ℃加热回流提取1次、后以12倍量的70%乙醇提取1次，每次2 h。合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥得野菊花总提物CIE。CIE加适量水使之分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)萃取，所得萃取物分别减压蒸干，冻干得野菊花PEE、EAE及NAE。CIE、PEE、EAE及NAE以DMSO复溶制成0.1 g/mL(以提取物计)原液，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃避光密封保存备用。

1.2.2 细胞培养 采用DMEM+10%FBS+100 U/mL青链霉素双抗培养基，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，观察细胞处于对数生长期即用于实验。

1.2.3 倒置荧光显微镜观察细胞形态 取对数生长期的各肿瘤细胞，制成浓度1.5×105个/mL悬液接种至6孔板，每孔2 mL。 培养24 h后加药处理，使CIE、PEE、EAE及NAE的终浓度为150 μg/mL。继续培养24 h，倒置荧光显微镜观察。

1.2.4 CCK-8法评价细胞增殖抑制作用 取对数生长期的各肿瘤细胞，制成浓度5×105个/mL悬液接种至96孔板，每孔100 μL。CIE、PEE、EAE及NAE制备5个浓度: 250、200、150、100、50 μg/mL，同时设阴性对照组和空白对照组，每组复孔5个。培养24 h后加药，药物处理24 h，每孔加入CCK-8试剂 20 μL，孵育4 h，水平摇床振荡10 min，酶标仪450 nm波长测定OD值。实验平行3次,根据公式计算细胞增殖抑制率(Cell Inhibition Rate, IR):

1.2.5 Hoechst染色法观察MCF-7细胞凋亡 取MCF-7细胞按1.2.3中方案接种并培养。PEE、EAE及NAE制备2个浓度: 150、50 μg/mL。加药继续培养24 h后取出，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定并使用Hoechst染色试剂染色5 min，再次洗涤，置荧光倒置显微镜下观察。

1.2.6 划痕实验评价MCF-7细胞迁移 取MCF-7细胞制成浓度为3×105个/mL悬液，每孔2 mL接种至6孔板，培养至细胞铺满孔底面积的80%～90%，用200 μL移液枪头在孔底均匀划线，PBS洗净细胞碎片，加入含PEE、EAE或NAE 50 μg/mL的低血清浓度培养基(2%FBS)，培养24 h后PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定，置荧光倒置显微镜下观察。

1.3统计学分析各组实验数据采用均数±标准差表示， SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析， 各实验组结果与阴性对照组的比较采用t检验，P<0.05为差异具有显著性。

2 结 果

2.1 CIE、PEE、EAE和NAE对各肿瘤细胞形态的影响A549、MCF-7和K562细胞经CIE处理后细胞皱缩、破碎，密度降低，但HepG2细胞经CIE处理后，细胞形态和密度变化不明显。由图1可见， A549、MCF-7和K562经由PEE和EAE处理24 h后均出现明显的皱缩、破碎、胞体暗淡、边缘粗糙、数目稀少等情况；而由NAE处理24 h后的三种细胞形态与密度较阴性对照组变化不大。

2.2 CIE、PEE、EAE及NAE对各肿瘤细胞增殖抑制作用

2.2.1 CIE对A549、K562、MCF-7和HepG2细胞的作用 如图 2 所示，与阴性对照相比，CIE在150～250 μg/mL浓度范围对A549、K562和MCF-7细胞增殖均有抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中， CIE对MCF-7细胞增殖抑制作用最强但不呈浓度相关性；对A549及K562细胞增殖抑制强度次之并呈现较好的浓度相关性。CIE对HepG2细胞无增殖抑制效果，反而呈与剂量相关的促增殖作用。

图1 野菊花PEE、EAE、NAE对肿瘤细胞形态的影响(24 h，100×)

图2 CIE对肿瘤细胞增殖抑制作(24 h后与阴性对照组相比，*P<0.05，n=3)

2.2.2 PEE、EAE及NAE对A549、K562和MCF-7细胞的作用 如图3所示，与阴性对照相比， 浓度为50～250 μg/mL的PEE与EAE对MCF-7和K562细胞增殖呈剂量依赖性强抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)，而对A549细胞的作用较弱；NAE对A549及K562细胞的抑制效果不明显，对MCF-7细胞具有一定的增殖抑制作用，但其强度明显弱于PEE和EAE，且非浓度依赖。

2.3 PEE、EAE及NAE对MCF-7细胞凋亡的影响

MCF-7细胞经过两个不同浓度PEE、EAE和 NAE处理后的Hoechst33342染色结果如图4所示。与50 μg/mL处理组相比，100 μg/mL PEE、EAE处理后的MCF-7细胞密度明显变小，形成致密浓染的细胞核数目更多。结果表明，PEE、EAE对MCF-7细胞有一定的凋亡诱导作用。

图3 PEE、EAE及NAE对肿瘤细胞的增殖抑制作用 24 h后与阴性对照组相比，*P<0.05，n=3A：对A549细胞增殖抑作用；B：对K562细胞增殖抑制作用；C：对MCF-7细胞增殖抑制作用

图4 PEE、EAE及NAE对MCF-7细胞的凋亡诱导作用(24 h，Hoechst染色，100×)

2.4 PEE、EAE及NAE对MCF-7细胞迁移的影响MCF-7细胞经PEE、EAE及NAE处理24 h后，细胞向划痕空白部位迁移情况如图5所示。与阴性对照相比，EAE处理组细胞向划痕空白处迁移数目极少，而其它处理组均有较多细胞迁移；提示EAE对MCF-7细胞的迁移的抑制效果最好，而PEE和NAE作用次之。

图5 PEE、EAE及NAE对MCF-7细胞迁移的影响(24 h，40×)

3 讨 论

野菊花提取实验选择乙醇为提取溶剂的原因在于，乙醇提取效果好，易于回收和处理，且更加安全低毒[9]。采用单因素轮换法对影响野菊花提取物的提取效率的因素(乙醇水溶液的浓度、加入料液比例、提取时间和提取次数等)进行优化，加入12倍量的70%乙醇(考虑干燥药材粉末需吸水溶胀，第一次加入15倍量)，65 ℃提取2次，每次2h，提取效果较好，所得CIE产物相对较高，方法亦较为简便经济。

CIE对HepG2细胞增殖不抑反促，很可能由于CIE中含有对HepG2细胞产生营养和促进生长作用的某些成分，而并不含能对其产生抑制作用的成分；或产生抑制作用的成分尚达不到有效浓度。另外，三个极性部位中仅有NAE对MCF-7细胞的作用不呈浓度依赖，因此我们推测，CIE对MCF-7细胞作用没有浓度相关性，可能与存在于NAE中的某些成分的作用有关。

本研究结果显示野菊花抗肿瘤活性较强的部位为石油醚(PEE)和乙酸乙酯部位(EAE)，这与文献报道野菊花的乙酸乙酯部位提取物具有逆转肿瘤多药耐药性的作用相一致[10]。已有研究证明，野菊花醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位主要含萜类及黄酮类化合物[11]；且萜类及黄酮类化合物的抗肿瘤作用近来已有诸多报道，如从野菊花中分离得到的三萜类能抑制小鼠皮肤肿瘤的活性[12]，黄酮类成分芹菜素通过抑制STAT3信号诱导乳腺癌细胞凋亡[13]，木犀草素具有一定的抗乳腺癌活性[14]。本文推测，野菊花中的抗肿瘤的活性成分可能为萜类、黄酮和脂类生物碱。本研究为后期分离获得单个或一系列抗肿瘤活性的单体化合物提供研究方向。

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ScreeningofantitumoractivefractionsofChrysanthemumIndicum

QUAN Wenjie, SHI Xiaoxin, XIONG Runde, et al

(InstituteofPharmacy&Pharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo evaluate the antitumor activity and screen the antitumor activity fractions of Chrysanthemum Indicum.MethodsMorphological observation,CCK-8,Hoechst nuclei staining and wound healing assay were used to evaluate the antitumor activity of CIE，PEE，EAE and NAE in tumor cells including human lung cancer cells (A549), human erythroleukemia cells (K562), human breast cancer cells (MCF-7), and human liver cancer cells (HepG2).ResultsShrinkage and fragmentation of cells could be seen obviously under the fluorescent inverted microscope when A549, K562 and MCF-7 cells were treated with CIE，PEE，EAE，NAE when their concentrations were above 150μg/mL. The proliferation of A549,K562 and MCF-7 cells can be inhibited by CIE，PEE，EAE，NAE in a dose-dependent manner in the concentration from 150μg/mL to 250μg/mL, PEE showed the best inhibition effects in MCF-7. EAE showed the best apoptosis-inducing effect in MCF-7, and did the best in resisting MCF-7 cell migration .ConclusionChrysanthemum indicum has antitumor activity and its mechanism might be associated with induction of apoptosis and inhibition of migration; the antitumor activity sites were the petroleum ether and ethyl acetate fractions, which provides the basis for further study in single compounds isolation.

Chrysanthemum indicum; tumor cells; antitumor activity; screening of antitumor activity fractions

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.007

2016-12-31；

2017-03-23

湖南省中医药科研计划重点项目(201412)；湖南省教育厅科学研究项目(16K079).

*通讯作者，E-mail：1025165380@qq.com.

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蒋湘莲)