c-Jun氨基末端激酶基因表达与急性脊髓损伤大鼠神经功能修复状态的关联研究

汪勇刚许永涛*王大鹏徐林军

c-Jun氨基末端激酶基因表达与急性脊髓损伤大鼠神经功能修复状态的关联研究

汪勇刚1许永涛1*王大鹏2徐林军3

目的探索急性脊髓损伤后大鼠脊髓组织中c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase,JNK）基因表达与神经功能修复状态的关联。方法取健康成年雄性大鼠50只，随机选取，假手术对照组18只，实验组32只。损伤后1、12、24、72 h行 PCR检测，比较大鼠脊髓组织中 JNK（JNK1、JNK2、JNK3）表达水平变化；损伤后12、72 h选取L4/5节段脊髓行HE染色、，比较脊髓损伤大鼠脊髓组织细胞凋亡情况、神经功能变化状态（NSS）。结果PCR结果显示，髓损伤大鼠脊髓组织中JNK1、JNK2、JNK3的表达，在损伤后1、12、24、72 h除 JNK3在相应时点表达水平与假手术组比较水平下降外，其他两项表达与假手术对照组无明显差别。L4/5脊髓HE染色结果提示，与假手术组比较，损伤后12 h损伤的脊髓皮质周边区HE染色阳性细胞显著增多。随着时间推移，染色阳性细胞出现明显减少的趋势，损伤后12 h的染色阳性细胞明显少于72 h。损伤组NSS评分则明显更高，但脊髓损伤组损伤后不同时点比较，NSS评分渐减。结论脊髓损伤后出现JNK3表达下调的情况，可能与神经细胞凋亡以及促进损伤后神经功能的恢复有关联。

c-Jun氨基末端激酶；急性脊髓损伤；神经功能修复；动物实验

脊髓损伤的发生率近年来呈现逐年增高的趋势，常可导致损伤节段以下肢体瘫痪等功能障碍。损伤轻者导致脊髓震荡，表现为损伤后出现短时间功能抑制，一般不会有明显的器质性病理改变出现，显微镜下仅有少量水肿，神经细胞或纤维一般未发生损害。损伤重者出现脊髓休克，是较严重的创伤，会出现相应的病理损害，会出现暂时的功能完全抑制，临床常见的特征为迟缓性瘫痪，同时出现脊髓反射和病理反射的消失等[1,2]。脊髓损伤给患者本人带来严重身心伤害，同时给整个社会造成巨大的经济负担，因此越来越多的研究开始关注本病的机理与诊治。早在上世纪就已发现 c-Jun氨基末端激酶（JNK）是与神经功能相关的MAPKs（Mitogen activated protein kinases,MAPKs）的一条重要信号转导通路之一，它与很多蛋白的异常磷酸化以及神经元的丢失密切关联[3,4]。有研究提示脑脊髓损伤后氨基末端激酶通路的激活可能参与神经细胞凋亡和神经功能的恢复。JNK由JNK1、JNK2、JNK3基因编码，其中 JNK1、JNK2在各种组织细胞中广泛表达而JNK3主要在神经系统、心脏、睾丸表达[4,5]。

本研究就大鼠脊髓损伤后JNK基因表达变化及其与神经元凋亡及神经功能改变的关系进行讨论，以利进一步阐明JNK表达与大鼠急性脊髓损伤后神经功能修复状态之间的关联。

1 对象与方法

1.1 造模与分组

采用改良的Allen's造模法，应用重物下落敲击的方法制备大鼠脊髓损伤模型。其原理是通过对重物质量的不同以及下落高度的调整制造出不同程度和类型的损伤模型，同时不损伤硬脊膜，避免外源性物质进入脊髓内部造成干扰。实验动物总共50只，均为健康成年雄性大鼠，随机选取，假手术对照组18只，实验组共32只。

损伤后1、12、24和72 h行PCR检测，假手术组6只大鼠，实验组各时点分别取4只大鼠用于实验，比较1、12、24和72 h的PCR结果；损伤后12、72h选取L4-5节段脊髓行HE染色，并比较两个时点的脊髓组织细胞凋亡情况分析损伤情况，假手术组6只大鼠，实验组各时点分别取4只大鼠；损伤后对4个时点进行评估神经功能分析（NSS），假手术组6只大鼠，实验组各时点分别取4只大鼠。其中PCR实验：四个时间点，每个时间点4只大鼠，共16只；NSS测定：四个时间点，每个时间点4只大鼠，共16只；HE染色：两个时间点，每个时间点4只，共需8只，是从上述PCR和NSS实验的32只大鼠中随机选取。

1.2 比较方法

1.2.1 PCR检测检测

引物设计，在Pubmed上搜索基因保守序列，利用primer premier5.0软件（PaloAlto,CA,USA）设计目的基因JNK1、JNK2、JNK3等引物序列（大连宝生物公司，中国）。比较损伤后1、12、24、72 h JNK1、JNK2、JNK3变化情况。

1.2.2 NSS评分

损伤后进行评分。正常鼠为0分，1～6分为轻度损伤，7～12分标为中度损伤中度，13～18分为重度损伤，神经功能完全丧失为18分。

1.3 统计学方法

SPSS 17.0统计软件包用于数据分析。统计学分析，计数数据以（均数±标准差）表示，组间比较使用方差分析以及两两比较的q检验等。

2 结果

2.1 脊髓损伤后大鼠脊髓组织中JNK表达水平变化

损伤后1、12、24、72h的JNK1、JNK2、JNK3的PCR结果比较发现，仅JNK3在损伤后这几个时点表达水平与假手术组比较水平下降（假手术组PCR实验时间点为术后24 h），其他两个分子表达与假手术对照组无明显差别（见表1，图 1）。

图1 脊髓损伤后大鼠脊髓组织中JNK1、JNK2、JNK3表达与对照组的比较。

2.2 脊髓损伤大鼠脊髓组织细胞凋亡情况

本研究选取L4/5脊髓进行HE染色。结果提示，与对照组比较（假手术组染色时间点为术后24 h），损伤后12h大鼠损伤皮质周边区HE染色阳性细胞显著增多。损伤后随着时间推移，染色阳性细胞出现明显减少的趋势，损伤后12 h的染色阳性细胞明显多于72 h。如表2所示。对照组中脊髓组织中神经元细胞分布排列整齐，神经元细胞核清晰可见，多分布于细胞中间位置，细胞尼氏体细颗粒状物质散在均匀分布；实验组神经纤维排列紊乱，髓鞘、轴突崩解碎裂，雪旺细胞增多，脊髓中神经元排列分布不均匀，神经元数量减少，同时可见神经元细胞肿胀或者变性凋亡，细胞核核仁向细胞边缘靠拢（见图2）。

表2 脊髓损伤后大鼠脊髓组织细胞凋亡情况与对照组比较

图2 实验组与对照组HE染色图片

2.3 脊髓损伤后大鼠神经功能变化

对照组（假手术组染色时间点为术后24 h）NSS评分与实验组比较提示，损伤组NSS评分更高；脊髓损伤组损伤后72 h NSS评分更低（见表3）。

表3 脊髓损伤后NSS评分与对照组比较

3 讨论

JNK能被许多应激因子激活，是参与使核转录因子 c-Jun的氨基活化区磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。人体周围神经损伤修复的关键环节之一就是神经元细胞体抗凋亡和神经轴突再生长，其中MAPKs信号通路参与细胞生长、分化、凋亡等过程，而JNK作为MAPKs家族的亚族，当其被磷酸化后会由细胞质转位至细胞核内，并且通过与特定位点结合参与下游核因子反应，从而参与神经功能的调节与修复[6,7]。目前JNK在神经细胞调亡中所起作用尚不十分明确，特别是在脑脊髓损伤中的研究还有待纵深讨论。JNK家族中的JNK3，现有研究结果支持JNK3扮演促神经细胞调亡的角色，其在神经细胞调亡的启动中起到了重要作用[8,9]。有研究发现JNK3可以促进神经相关细胞的激活等功能，另有研究提示细胞周期蛋白依赖性激酶5可能参与了JNK3的负调控过程，具有一定的防止神经细胞调亡的作用[10,11]。这些研究逐步论证了JNK特别是JNK3在神经细胞调亡中起到的作用。本研究结果提示，损伤后各时点的PCR结果仅JNK3表达水平与假手术组比较水平下降，其他两个分子表达与假手术对照组无明显差别。印证了前人研究的一些结论。JNK为应激活化蛋白激酶，其中的JNK3在脑组织中表达很多，有实验结果表明，神经元凋亡损伤与JNK的激活有关，比如脑组织缺血和再灌注的过程都有可能诱导不同部位的神经元出现迟发性凋亡；另有研究从基因敲除的角度也证明了JNK3在脑部缺血性病变引发的神经元凋亡中确实起到了一定的作用[8,9,11]；而这些情况在脊髓的损伤中也存在，故本研究出现的JNK3在假手术组与实验组中表达的差异征印证了JNK3在脊髓损伤中起到的作用。另外，本研究也从神经功能评价角度来说，假手术组在损伤后神经功能有少许损伤；损伤组NSS评分明显增加，提示损伤对神经功能造成了严重影响。脊髓损伤组损伤后各个时点比较，NSS评分呈减少趋势，表明损伤后大鼠神经功能在逐渐恢复。总之本研究几项结果均提示JNK3在脊髓损伤后表达下调，参与了神经细胞凋亡过程，而其表达下调可能促进损伤后神经功能的恢复[12-15]。

此外，本研究选取L4-5脊髓进行HE染色，结果提示与假手术组比较，损伤后大鼠损伤皮质周边区HE染色阳性细胞显著增多，且损伤后随着时间推移，染色阳性细胞出现明显减少的趋势。从形态角度来说，对照组中脊髓组织中神经元细胞分布排列整齐，神经元细胞核清晰可见，多分布于细胞中间位置，细胞尼氏体细颗粒状物质散在均匀分布；实验组神经纤维排列紊乱，髓鞘、轴突崩解碎裂，雪旺细胞增多，脊髓中神经元排列不均，神经元数量减少，神经元细胞肿胀凋亡。都佐证了脊髓损伤后可以出现JNK3表达下调的情况，可能与神经细胞凋亡以及促进损伤后神经功能的恢复有关联。

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A study for the association between c-Jun N-terminal kinase gene expression and recovery of neural function in acute spinal cord injury rats

Wang Yonggang1,Xu Yongtao1,Wang Dapeng2,et al.1 The Third Department of Orthopedics,Jingzhou Central Hospital,Jingzhou Hubei,434020;2 Department of Orthopedics,Songzi TCM Hospital,Songzi Hubei,434200;3 Department of Orthopedics,People's Hospital of Shishou,Shishou Hubei,434400,China

Objective To explore the association between spinal cord tissue state c-Jun N-terminal kinase（JNK）gene expression and recovery of neural function acute spinal cord injury. Methods 50 healthy adult male were randomly selected sham group 18, a total of 32 experimental group. Comparing the injury spinal cord tissue JNK expression levels as well as spinal cord injury in spinal cord tissue cell apoptosis and NSS change state after injury. Results The cord injury in spinal cord tissue JNK1, JNK2, JNK3 expression were examined for the comparison and found that among the groups after 1,12, 24, 72 h after the injury JNK3 expression level of sham group level showed difference after injury. And in this study we selected L4/5spinal cord HE staining, the results suggested that compared with the sham group, 12 h after injury in cortical damage the surrounding area HE staining positive cells increased significantly. After the damage, staining positive cells was significantly reduced. Sham group of 24 h the NSS score showed a small increase, while in the injury group the NSS score was significantly increased; compared various time points after spinal cord injury group, the NSS scores tended to decrease. Conclusion JNK3 downregulated after spinal cord injury may be associated with neuronal apoptosis,the downturn is likely to promote the recovery of nerve function after injury.

c-Jun N-terminal kinase; Acute spinal cord injury; Recovery of neural function; Animal experiments

R744

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.06.011

swgk2016-08-00201

1荆州市中心医院骨科三病区，湖北荆州434020；2松滋市中医院骨科，湖北松滋434200；3石首市人民医院骨科，湖北石首434400

汪勇刚（1978-）男，硕士，主治医师。研究方向：骨外科。

*[通讯作者]许永涛（1975-）男，博士，主任医生。工作方向：脊柱外科。

2016-08-25）