江西某铀矿堆浸尾渣微生物群落演替研究

郭 勤，苗瑾超，张宏举，王 慧，高 蕾

（新疆大学科学技术学院阿克苏校区，新疆阿克苏 843000）

江西某铀矿堆浸尾渣微生物群落演替研究

郭 勤，苗瑾超，张宏举，王 慧，高 蕾

（新疆大学科学技术学院阿克苏校区，新疆阿克苏 843000）

应用16SrDNA基因文库技术研究了江西某铀矿堆浸尾渣冬季到次年夏季微生物群落演替情况。结果表面：冬季Acidimicrobium ferrooxidans占48.5%，Leptospirillum ferriphilum占17.5%，Xanthomonas albilineans占11.3%，Mycobacterium sp占7.2%，其它异养菌占15.5%。夏季Leptospirillum ferriphilum占87.40%，Nitrobacter winogradskyi占1%，其它异养菌占11.6%，Acidimicrobium ferrooxidans未检出。

生物冶金；16SrDNA基因文库；微生物群落结构；铀矿

微生物应用于冶金工艺能显著降低能耗，减少投资，缩短工艺流程，降低环境污染。近年来，国内外微生物冶金技术应用于低品位和难处理铀矿石的浸出取得了良好的经济效益和环境效益，这使得微生物浸铀技术［1］成为世界许多国家铀矿资源提取和铀生产的支撑性术。用于铀矿生物浸出的微生物主要包含氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、铁氧化钩端螺旋菌以及嗜酸性硫杆菌等化能自养菌，还包括一些异养菌，真菌、酵母菌甚至藻类，多种微生物协同作用促进浸矿反应的进行，构成一个完整的微生态系统［2］。分析浸铀过程中矿石表面附着微生物的群落结构，可以了解不同微生物在浸铀过程中发挥的作用，能够推测浸铀过程中不同微生物之间的种间关系。浸铀不同阶段和不同的调控工艺会影响微生物群落结构。通过分析浸铀过程中各阶段的微生物群落结构，可以找出最有利于浸铀的群落分布，确定最佳的调控工艺。

自然界中99%的微生物都不能在实验室培养［3］，传统微生物纯培养不能反映矿石样品中微生物的丰度。微生物冶金工艺中大量1环境微生物的不可培养导致传统微生物生态学在揭示生物冶金工艺中微生物群落结构、生态功能及其相互关系的研究存在巨大障碍［4］。近年来由于分子生物学的理论和技术应用于环境微生物生态学中的研究逐步深入，环境微生物和冶金微生物多样性的研究有了突破性进展，微生物实时监测和高通量测序技术的应用使得其检测结果更加真实，大量以前未知的微生物新物种及其新基因得到鉴定和应用。随着16SrDNA序列分析技术作为微生物分类系统的主要方法和依据也得到了业内的认同［5］。近年来微生物核糖体DNA数据库的日益完善，16SrDNA基因测序技术成为细菌分类和物种分析鉴定的一个有效工具。16SrDNA基因序列分析、核酸指纹图谱分析以及建立16SrDNA基因克隆文库等分子生物学技术也为微生物物种多样性和物种功能基因组的研究提供了崭新思路。经过近几年的发展，16SrDNA技术已经日趋成熟，其研究方法更加完善，结果更加精确［6］。

江西某铀矿5 000 t级微生物堆浸工业化生产中经过酸化、浸出、洗堆三个步骤后，铀矿品位从1.76‰降低至0.1‰左右，浸出率达到90%以上。浸出尾期矿堆采用表面覆盖薄膜的办法继续放置，让微生物进一步作用于矿堆，达到提高浸出率、减少环境污染的目的。采用16SrDNA技术，通过构建重组基因文库，分析矿石表面吸附的细菌群落和组成，研究该堆浸尾渣从冬春季节放置6个月到次年夏季微生物种群的演替和变化规律，为研究浸铀微生物群落结构变化的影响因素提供参考。

1 试验方法

1.1 样品来源

江西某铀矿微生物堆浸浸出工业化试验尾期，尾渣矿堆中心，距表面40～50 cm深度的矿石样品，矿石表面湿润，呈现颗粒状，灰白色。第一次取样时间为2015年12月23日，第二次取样为2016年7月11日。

1.2 矿石表面吸附菌体收集及预处理

将25 g矿石样品放入50 mL无菌离心管中，加入25 mL pH为1.8的无菌水，通过漩涡振荡器（AVS－100）1 500 r／min反复多次震荡，将菌体从矿石表面洗脱。采用GL－21M高速冷冻离心机2 000 r／min离心 5 min，沉淀细沙和稀泥；采用 13 000 r／min离心20min沉淀菌体，用pH为8.0的TE缓冲溶液洗涤3次，获得白色透明的菌体。

1.3 细菌全基因组的提取及16SrDNA基因扩增

采用TaKaRa Fast DNA spin kit for soil试剂盒提取总DNA（具体操作见试剂盒说明书）。采用1%琼脂糖凝胶电泳，90 V电压，电泳30 min检测全基因组的提取质量。

16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。16SrDNA由于大小适中，约1.5 Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。采用1387R和27F引物对和EXtap DNA聚合酶对细菌全基因组16S核糖体RNA基因进行扩增，扩增反应体系见表1。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，电压90 V，电泳30 min左右检测。

表1 样品基因组16SrDNA扩增反应体系

反应程序：（1）94℃预热处理 5 min；（2）94℃变性40 s；（3）47℃退火30 s；（4）72℃延伸90 s；从（2～4），进行30个循环；（5）72℃充分延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，TAE缓冲体系，电压90 V，电泳30 min左右。

1.4 扩增产物的纯化回收

扩增产物中除了含有目的基因以外，还含有大量的酶、蛋白质等杂质，需进一步纯化后才能进行克隆文库的构建。通过电泳切胶回收工艺能对扩增产物进行有效回收：采用2%的琼脂糖凝胶电泳20～30 min分离DNA片段；在360 nm的紫外波长下，尽可能快地把所需的DNA片段切下来，之后采用TaKaraDNA胶回收试剂盒进行回收纯化。回收产物采用在1.5%的琼脂糖凝胶，90 V电压电泳20 min，检测回收效果。

1.5 重组克隆文库的构建

取1μL P－easy－T3连接体系，加入4μL回收PCR产物，在25℃温浴15min。采用translation1感受态细胞，42℃，热激65 s，获得重组克隆子。重组细胞均匀涂布于终浓度为100μg／mL AMP（氨苄青霉素）、40μL 2%X－gal和7μL 20%IPTG的新配LB固体培养基中，在37℃恒温培养箱中倒置培养12 h，观察菌落数目，进行蓝白斑筛选。

1.6 重组克隆文库16SrDNA基因组的ALU1酶切数据统计

随机挑取阳性克隆120个，采用T7和SP6引物和LATap聚合酶做16SrDNA基因菌落PCR。菌落PCR扩增反应体系见表2。

表2 阳性菌落PCR扩增反应体系

反应程序：LID＝105℃，95℃ 4 min，60℃ 1 min［94℃ 40 min，55℃ 40 s，72℃ 1min 30 s］29个循环，72℃10 min hold 10℃。获得重组克隆文库16SrDNA以后采用限制性内切酶ALU1于37℃反应125 min进行酶切分析，酶切反应缓冲体系见表3。

表3 酶切反应体系

酶切反应产物在2%浓度的琼脂糖凝胶，60 V电压电泳40～50 min，才凝胶成像系统拍照分析统计。对酶切图谱进行分类统计，从实验室酶切图谱数据库中对照，对未知的图谱挑取单克隆进行测序分析（上海生物工程有限公司）。根据测序结果在NCBI数据库中比对将统计结果进行分析对比。

2 试验结果及其分析

试验稀有度曲线如图1所示。

图1 试验克隆数目稀有度曲线

通过图1可以看出本试验选取的克隆文库选择的样本容量能够代表整体。

将酶切结果以及测序后查询NCBI数据库后的结果做统计，统计结果见表4、表5。

通过表4可看出：堆浸结束初期（冬季）Acidimicrobium ferrooxidans占48%，Leptospirillum ferriphilum占18%，其它异养菌占34%，矿石表面检测出14种不同的微生物。自养菌比例为66%，异养菌比例为34%。

通过表5可看出：堆浸尾渣放置6个月以后（夏季）Leptospirillum ferriphilum占87.4%，存在1%的Sulfobacillus acidophilus，Acidimicrobium ferrooxidans在群落中逐渐消失，其它异养菌的比例为11.6%，矿石表面有9种不同的微生物。自养菌比例为88.4%，异养菌比例为11.6%。

整个过程Acidimicrobium ferrooxidans菌的比例逐渐降低，由48%缩减至小于1%，Leptospirillum ferriphilum逐渐转变为主要菌群，由1月份的18%上升为87.4%，Sulfobacillus acidophilus等硫氧化细菌也有一定的繁殖，异养菌的比例由34%降低至11.6%。

表4 冬季群落结构

表5 次年夏季群落结构

3 讨 论

一些研究表明：铀矿浸出微生物菌群种类和铜矿类似，菌群结构有所不同。影响浸矿微生物群落结构有很多因素，Schrenk等的研究表明Leptospirillum ferriphilum的分布与低pH值紧密相关。Edwards等利用荧光原位杂交的方法对位于美国铁矿的Leptospirillum ferriphilum菌进行定量分析，发现在温度较高、pH较低的环境下Leptospirillum ferriphilum比Acidimicrobium ferrooxidans生存得更好［7］。周洪波等的研究表明对同一pH条件不同的浸出时间进行比较；发现不控制pH时，开始阶段Acidimicrobium ferrooxidans是优势种群，但后期Leptospirillum ferriphilum代替Acidimicrobium ferrooxidans成为优势种群；控制pH时，Leptospirillum ferriphilum始终是优势种。Cecilia S等对低品位黄铜矿堆浸工艺过程中的生物特性进行了研究，发现演替分三个过程：从第l到第225 d，Acidithiobacillus ferrooxidans占优势；在第 255 d到598 d，Leptospirillum ferriphilum开始取代 Acidithiobacillus ferrooxidans，成为浸出液中主要优势群体。此后，在第598 d到749 d，类Sulfobacillus属的菌种成为优势种群［8］。刁梦雪等研究了低品位铜矿柱浸及酸性矿坑废水微生物群落在高Fe3＋浓度下的演替规律，发现Acidimicrobium ferrooxidans和Leptospirillum都可利用亚铁，而且在无三价铁离子或低浓度三价铁离子条件下Acidithiobacillus ferrooxidans为优势菌群。但在三价铁离子浓度较高的情况下，由于Leptospirillum ferriphilum与Acidimicrobium ferrooxidans相比，对于三价铁离子的抑制作用更不敏感，且氧化亚铁的能力受到抑制更少，因此Leptospirillum ferriphilum比例增加［9］。

本文研究的体系，冬季采样之前，矿堆依然在喷淋，环境中一些异养菌会通过喷淋液进入矿堆内部，导致异养菌的比例比较高。矿堆浸出结束喷淋时刻浸出液中存在1 g／L左右的Fe2＋，前人研究表明：在Fe2＋条件情况下有利于Acidithiobacillus ferrooxidans的生长，而Leptospirillum ferriphilum的生长受到抑制。初期由于 Fe2＋的存在使得 Acidithiobacillus ferrooxidans菌群比例较高。随着矿堆放置的过程，矿堆内部Fe2＋逐渐消耗，在高 Fe3＋体系下 Acidithiobacillus ferrooxidans活性受到抑制［10］，Leptospirillumferriphilum对于三价铁离子的抑制作用更不敏感，比例会逐渐增加。在堆浸末期，耗酸物质基本消耗完全，堆内pH维持在1.5～2.0左右；前人研究认为：温度较高、pH较低的环境下 Leptospirillum ferriphilum比Acidithiobacillus ferrooxidans生存得更好。从1月份到7月份，环境温度逐步升高，堆内温度也相应提高，Leptospirillum ferriphilum菌群的比例增加。

［1］ 苑俊廷，孙占学.细菌堆浸浸铀技术的发展及展望［J］.中国矿业，2008，15（6）：45－48.

［2］ 朱宏飞，李辉，刘东奇.三种浸矿细菌协同作用的回顾及展望［J］.微生物学通报，2016，43（12）：2 730－2 737

［3］ 彭伶俐，王琴，辛明秀.自然界中不可培养微生物的研究进展［J］.微生物学杂志，2011，31（2）：75－79.

［4］ 李晓然，栾建军，柳陈坚.微生物分子生态学研究方法及其存在的缺陷［J］.中国微生态学杂志，2013，25（2）：228－232.

［5］ 刘驰，李家宝，芮俊鹏，等.16SrRNA基因在微生物生态学中的应用［J］.生态学报，2015，35（9）：2 769－2 788.

［6］ 姚洪礼，李兴江，郑志，等.基于16SrDNA的醋酸菌筛选及其发酵特性［J］.食品科学，2017，38（4）：6－12.

［7］ 周洪波，谢英剑，罗海浪.中等嗜热细菌浸出黄铜矿过程中pH对群落结构的影响［J］.工业微生物，2009，27（9）：20－24.

［8］ 王军，李旖旎，庄田，等.黄铜矿精矿中等嗜热微生物浸出过程及其优化［J］.中国有色金属学报，2016，26（5）：1 120－1 128.

［9］ 刁梦雪.低品位铜矿柱浸及酸性矿坑废水微生物群落在高Fe3＋浓度下的演替规律［D］.长沙：中南大学，2009.

［10］蔡长江，卢桂宁，廖长君，等.氧化亚铁硫杆菌对黄铜矿的生物氧化研究［J］.地球与环境，2014，42（3）：361－368.

The Research of M icrobial Community Succession in Tailings of a Uranium M ine in Jiangxi

GUO Qin，MIAO Jin-chao，ZHANG Hong-ju，WANG Hui，GAO Lei
（Xingjiang University Institute of Science and Thechnology Akesu Campus，Akesu 843000，China）

Using 16SrDNA gene library technology，we studied the succession ofmicrobial communities in a uranium mine tailings during winter to the following summer in Jiangxi.The results surface：Acidimicrobium，ferrooxidans accounted for 48.5%，Leptospirillum ferriphilum accounted for 17.5%，Xanthomonas albilineans accounted for 11.3%，Mycobacterium SP accounted for 7.2%，and other heterotrophic bacteria accounted for 15.5%.In summer，Leptospirillum ferriphilum accounted for 87.40%，Nitrobacter winogradskyi accounted for 1%，other heterotrophic bacteria accounted for 11.6%，and Acidimicrobium ferrooxidans was not detected.

biologicalmetallurgy；16SrDNA gene library technology；microbial community structure；uranium mine

TF18

A

1003－5540（2017）06－0028－04

新疆大学科学技术学院教学改革项目（2017020101008）新疆大学科学技术学院2017版本科专业培养方案项目（2017020101004A5）新疆大学科学技术学院大学生创新项目（2017020101009B6）

郭 勤（1989－），男，讲师，主要从事湿法冶金、化学分析专业教学与科研工作。

2017－09－28