荭草苷和木犀草素对人红细胞自然老化的保护作用

2017-12-22王树林王晓茹曹欣欣王书华

中国老年学杂志 2017年23期

关键词：膜蛋白草素木犀

王树林王晓茹曹欣欣王书华

(河北北方学院药学系，河北张家口 075000)

荭草苷和木犀草素对人红细胞自然老化的保护作用

王树林1王晓茹曹欣欣王书华

(河北北方学院药学系，河北张家口 075000)

目的探讨荭草苷和木犀草素对人红细胞自然老化的保护作用及构效关系。方法采用健康成年人去白细胞抗凝血制成红细胞悬浮液，建立自然老化模型。测定红细胞溶血度，抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性，丙二醛(MDA)浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析损伤红细胞膜蛋白变化，采用扫描电镜和透射电镜观察红细胞形态及红细胞膜骨架超微结构。结果荭草苷、木犀草素均能较显著抑制红细胞溶血，保护抗氧化酶活性及ATPase活性，同时荭草苷、木犀草素还能显著降低MDA含量(P<0.05,P<0.01)，对红细胞膜蛋白具有保护作用，明显改善红细胞形态及超微结构。结论荭草苷和木犀草素对人红细胞自然老化的保护作用是通过直接对抗氧自由基损伤和保护抗氧化酶系活性及红细胞结构功能的完整性而实现的。

荭草苷；木犀草素；红细胞；自然老化

红细胞膜富含不饱和脂类及铁，最易遭受氧自由基氧化损伤〔1〕。荭草苷属黄酮碳苷类〔2〕，其体外具有清除羟基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼能力及对红细胞溶血的保护作用〔3〕，体内对D-半乳糖致衰老小鼠组织细胞膜的转运能力的改善是通过抗氧化活性来实现的〔4〕。木犀草素属黄酮苷元类〔5〕，具有保护心血管、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用〔6～8〕。荭草苷和木犀草素结构相似，仅在荭草苷A环C-8位上相差一个葡萄糖基，那么这一结构差异对荭草苷和木犀草素抗氧化活性又有何影响呢？本研究以人红细胞为研究对象，采用自然老化红细胞模型，以维生素C(VC)为阳性对照，比较荭草苷和木犀草素对人红细胞的保护作用并阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 UV-9100紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；S-3400N扫描电镜、H-7500透射电镜、E-1010离子溅射装置：日本日立；新鲜去白细胞抗凝血，张家口市中心血站提供；荭草苷，自制，纯度达到98%以上；木犀草素，天津一方科技有限公司；VC，天津市化学试剂一厂；丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、三磷酸腺苷(ATP)、过氧化氢酶(CAT)、甘谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、唾液酸(SA)测定试剂盒均购买自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20120417、20120417、20120420、20120419、20120417、20120419。

1.2红细胞悬液的配制红细胞取自健康人静脉血，离心除去血浆和白细胞。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，配制2%的红细胞悬液。

1.3自然老化模型建立〔9〕4 ml 2%的红细胞悬液于37℃电热恒温培养箱中孵育0，12，24，48，72 h，取反应液，分别用生理盐水和蒸馏水稀释10倍，离心(4℃，2 500 r/min，10 min)，412 nm处测定吸光度值，检测溶血率，确定最佳老化时间。

1.4分组与给药荭草苷和木犀草素溶液的配制：荭草苷和木犀草素用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再加甲醇(CH3OH)稀释。实验分为模型组、正常组、VC组(20 μg/ml)、荭草苷和木犀草素(40，20，10 μg/ml)各三个剂量组，给药组给药后37℃孵育48 h。

1.5测定指标

1.5.1溶血率取试管红细胞反应液，分别用生理盐水和蒸馏水稀释5倍，412 nm处测定吸光度值，检测溶血率。

1.5.2抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性、MDA浓度测定SOD、CAT、GSH-Px、ATPase、唾液酸(SA)和MDA；测定方法根据试剂盒说明操作。

1.5.3膜蛋白变化观察红细胞膜的制备：红细胞反应液离心(2 500 r/min，10 min)，按1∶30的体积比与预冷的低渗磷酸盐缓冲液(5 mmol/L Na2HPO4，0.1 mmol/L PMSF，pH8.0)混合，置于4℃冰箱中溶血1 h。然后离心(4℃，15 000 r/min，20 min)弃上清后用低渗磷酸盐缓冲液洗3次，离心(4℃，19 000 r/min，20 min)，即可得到乳白色的红细胞膜蛋白样品。将所得红细胞膜蛋白定量，然后与等渗PBS混合，使蛋白终浓度为1 mg/ml，放在-80℃冰箱。将红细胞膜进行SDS-PAGE分离后，用凝胶成像系统观察、照相。

1.5.4红细胞膜表面形态观察将自然老化的红细胞分别与2%戊二醛以1∶100的比例混合，固定过夜，用PBS浸洗3遍，脱水干燥后放入E-1010离子溅射装置喷金，S-3400N扫描电镜观察、拍照。

1.5.5膜骨架结构观察将自然老化的红细胞膜与含2.5%(W/V)TritonX-100的5 mmol/L NaPi(pH7.0)溶液，以1∶4混合，0°C放置1 h。取混合液滴到铜网上，蒸馏水洗涤3次，1%的醋酸双氧铀负染5～10 s，滤纸吸干后用H-7500透射电镜观察红细胞膜骨架结构。

1.6统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行t检验。

2 结果

2.1红细胞自然老化模型建立红细胞孵育0，12，24，48，72 h后，随着孵育时间的延长溶血率逐渐增大〔(6.38±1.02)%、(11.35±2.43)%、(23.69±2.54)%、(37.58±2.44)%、(43.20±3.19)%〕。相邻孵育时间点溶血率相比，除12、24、48 h之间差异显著(P<0.01)，其余时间点均无差异。所以选48 h为红细胞自然老化模型孵育时间。

2.2药物对红细胞自然老化溶血的影响红细胞自然老化后，出现严重的溶血现象，与正常组〔(6.38±1.02)%〕相比，模型组溶血率有显著增高〔(37.58±2.44)%，P<0.01〕；与模型组相比，不同给药组对自然老化引起的溶血有抑制作用且呈剂量依赖性(P<0.05，P<0.01)；荭草苷10，20 μg/ml浓度组〔(31.46±2.61)%、(26.81±2.18)%〕，抗溶血作用弱于10、20 μg/ml木犀草素组〔(27.11±1.67)%、(20.47±2.09)%，P<0.05，P<0.01〕，红草苷与木犀草素40 μg/ml浓度组相比无显著差异〔(13.25±2.25)%、(14.06±1.88)%，P>0.05〕；与VC组〔(12.88±2.37)%〕相比，荭草苷与木犀草素10，20 μg/ml浓度组抗溶血作用较弱，但差异显著(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml浓度组与VC无显著差异(P>0.05)。

2.3药物对红细胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA的影响红细胞自然老化后，抗氧化酶及ATPase活性、SA含量显著下降，MDA含量明显升高，与正常组相比有显著差异(P<0.01)；给予药物预处理后，各指标均有不同程度恢复，与模型组相比有显著差异(P<0.05，P<0.01)，且在一定范围内与浓度呈正相关；与相同浓度的木犀草素相比，荭草苷10，20 μg/ml浓度组抗氧化能力弱于木犀草素同浓度组(P<0.05，P<0.01)，而40 μg/ml荭草苷和木犀草素浓度组无显著差异(P>0.05)；与VC相比，荭草苷与木犀草素10，20 μg/ml浓度组抗氧化能力弱于VC 20 μg/ml浓度组(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml浓度组无差异(P>0.05)。见表1。

表1 药物对红细胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA水平的影响

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与同浓度木犀草素组比较：4)P<0.05，5)P<0.01；与VC组比较：6)P<0.05，7)P<0.01

2.4SDS-PAGE电泳结果红细胞自然老化后，血影蛋白和锚定蛋白发生聚集，带4.1a/带4.1b增大。给予药物预处理后，各给药组均能抑制血影蛋白、锚定蛋白条带聚集，并使带4.1a/带4.1b降低，见图1。

2.5扫描电镜观察结果正常红细胞呈同心型双凹圆盘状结构，表面光滑、饱满，基本无异常细胞。自然老化后，红细胞皱缩，体积减少，并发现有囊泡溢出。给予药物预处理后，细胞表面趋于平滑，皱缩减少，体积逐渐恢复正常，囊泡明显减少，以上变化与浓度呈正相关，见图2。

2.6透射电镜观察结果正常红细胞膜骨架结构清晰，网络状结构明显且网眼均匀、一致。老化后，网络状结构破坏，SP4和J点模糊难辨，给予药物预处理后，可以看到随药物浓度升高，对膜骨架的保护作用逐渐增强，荭草苷40 μg/ml组、木犀草素20 μg/ml组、VC组作用最为显著，但与正常组相比，仍存在一定差距。见图3。

A:模型组;B:正常组;C:40 μg/ml木犀草素组;D:20 μg/ml木犀草素组；E:10 μg/ml木犀草素组;M:Marker;F:20 μg/ml VC组;G:10 μg/ml荭草苷组;H:20 μg/ml荭草苷组;I:40 μg/ml荭草苷组图1 SDS-PAGE检测红细胞膜变化

图2 扫描电镜各组红细胞自然老化结果(×2 500)

图3 透射电镜观察各组红细胞自然老化结果(×30 000)

3 讨论

本研究显示，红细胞孵育48 h后，抗氧化酶、SA、ATPase活性下降，MDA含量升高，其机制可能是因为红细胞在人体血液中含量最多，其运动循环代谢主要通过多种酶完成，但当红细胞发生衰老时，抗氧化剂摄入减少导致抗氧化酶类活性降低，使多余自由基不能及时被清除，造成脂质过氧化损伤；在老化过程中，ATP生成减少，使能量代谢受阻，最终导致机体的严重损坏甚至坏死〔10〕。SOD、CAT、GSH-Px是机体内主要的抗氧化剂，它们相互保护、相互协同保护了机体免受活性氧的破坏〔11〕。一旦这个防御体系被破坏，机体内自由基的动态平衡将被打破，导致大量脂质过氧化物产生，其中最重要的是MDA，过量MDA造成细胞膜损伤〔12〕，另外，脂质过氧化损伤会造成ATPase活性降低，影响细胞变形性和完整性〔13〕。SA位于红细胞膜的糖蛋白与糖脂糖链末端，具有抗病毒、抗肿瘤、抗老年痴呆等生理活性，对研究机体老化机制具有重要意义〔14〕。本实验结果显示，荭草苷能够提高SA含量，并与浓度呈正相关，与Oldenborg等〔15〕研究结果一致。

红细胞膜由脂质双分子层及附着于内表面的膜骨架构成，膜骨架系统(六边网状的骨架结构)主要由血影蛋白、带4.1蛋白、肌动蛋白、加合蛋白和锚定蛋白等构成，血影蛋白所占比例最大(约55%)，一旦发生异常，就会使脂质双分子层与膜蛋白形成囊泡，脱离骨架，最终导致红细胞形态、结构和功能改变，影响红细胞正常生理功能〔16〕。本实验结果显示，给予药物处理后，膜蛋白、表面形态及骨架结构均得到一定程度的恢复，且恢复程度与剂量呈正相关。李静〔17〕研究了银杏叶提取物对人红细胞氧化损伤及自然老化的影响，证明银杏提取物不仅可有效保护膜蛋白，防止其因发生聚集，脱落而减少或消失，还对膜骨架及红细胞膜表面形态均有一定的保护作用，且有一定的剂量关系，与本实验结果相一致。本研究黄酮类化合物上的酚羟基有利于抗氧化，清除自由基〔18〕，研究中荭草苷与木犀草素B环上均有邻二酚羟基，有较强的抗氧化能力，但荭草苷10，20 μg/ml浓度组的对老化红细胞的保护弱于木犀草素同浓度组，40 μg/ml浓度组作用相当，可能原因是荭草苷A环8位上的糖基化造成空间位阻，使其抗氧化活性下降，这与文献〔19〕结果相一致。

荭草苷和木犀草素对人红细胞自然老化的保护作用是通过直接对抗氧自由基损伤和保护抗氧化酶系活性以及红细胞结构功能的完整性而实现的。在抗氧化药物构效选择上，10，20 μg/ml浓度组木犀草素的活性比荭草苷强，荭草苷A环上空间位阻影响了荭草苷的抗氧化活性。

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