迟发型脑血管痉挛致脑缺血后神经元自噬

王子珍 杨 堃 郑穿宜

(海南医学院附属医院神经外科，海南 海口 570100)

迟发型脑血管痉挛致脑缺血后神经元自噬

王子珍 杨 堃 郑穿宜

(海南医学院附属医院神经外科，海南 海口 570100)

目的探讨迟发型脑血管痉挛(DCVS)致脑缺血后神经元自噬的现象。方法建立自发性蛛网膜下腔出血(SAH)后DCVS兔模型，检测脑组织含水量以确定模型成功程度。在二次注血后的不同时间处死兔，取痉挛血管供血区域脑组织进行Western印迹、免疫组织化学等检测脑组织中神经元细胞坏死、凋亡和自噬现象。结果SAH兔模型脑组织中存在神经元细胞坏死、凋亡和自噬现象。梗死后24 h脑组织含水量相比梗死前增多(P<0.05)。Western印迹及免疫组化证实DCVS和神经元细胞自噬存在关联。结论DCVS致脑缺血组织中存在神经元自噬现象，脑血管痉挛的程度与神经元自噬存在一定的关联性。

迟发型脑血管痉挛(DCVS)；自发性蛛网膜下腔水血(SAH)；自噬现象

自发性蛛网膜下腔出血(SAH)是发病率最高的脑血管意外之一，颅内动脉瘤破裂出血是最常见的致病原因，迟发型脑血管痉挛(DCVS)是其最严重且常见的并发症之一〔1〕。DCVS与很多因素有关，如一氧化氮(NO)、炎症因子等，但机制尚未完全阐明。细胞自噬普遍存在于真核细胞中，是一种高度保守的细胞自我防御机制，是细胞在营养不足时诱发的适应性反应，可为各种生物学行为提供能量原料〔2，3〕。DCVS 后相应的供血区脑组织也处于供血不足状态，可能为类似于缺血半暗带的低灌注区或者大脑中动脉闭塞(MCAO)后的脑梗死〔4〕。因此设想，DCVS 后脑缺血组织中神经元自噬机制也可能被激活，并且与脑血管痉挛的程度可能存在一定的关联性。

1 材料和方法

1.1SAH动物模型的建立 参照Bederson等〔5〕的报道采用颈内动脉穿刺法建立兔模型。取正常体健兔，腹腔麻醉后固定在硬板上，股动脉插管监测兔血压，手术前及蛛网膜下腔出血后各测一次动脉血行血气分析。分离固定右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，吻合支对应结扎，将尼龙线从颈外动脉穿入颈内动脉部分，有阻力出现时进一步刺破血管，制作蛛网膜下腔出血模型，持续20 s将尼龙线取出，逐步结扎颈外动脉端，逐步恢复血流情况，缝合颈部切口。术中维持兔的正常生命状态。假手术(sham)组除了不刺破血管壁外，其余操作均与实验组一致。术后兔单笼饲养，注意保暖。

1.2脑水含量测定 麻醉药深度麻醉大鼠(每组5只)后迅速处死取出脑组织，放在冰上，去除脑皮质表面的脑膜和血凝块，作冠状位切片。所有组织用电子天平称量脑组织湿重，放入恒温烤箱烘烤2 h至恒重，置于干燥缸冷却后取出，测干重。脑组织含水量=(湿重-干重)。

1.3Western印迹蛋白免疫印迹 配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白样品。使用湿转法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，1∶1 000 TBST稀释一抗，4℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶5 000)稀释，室温孵育2 h；电化学发光法(ECL)检测。实验重复3次。采用的抗体：抗-LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ),抗-酶切Caspase-3,抗-Fodrin，抗-LAMP1，抗-tubulin。

1.4免疫组织化学 取与痉挛血管相应的供血区兔脑组织，采用 ABC 法进行免疫组化染色，然后在共聚焦显微镜下观察。选用的抗体包括抗-LC3(LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ)、抗-酶切Caspase-3、抗-Fodrin、抗-LAMP1及抗-tubulin。

1.5统计与分析 采用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1一般生理情况 在整个实验过程中，时刻监测兔的动脉压、血压和心率，建模前和蛛网膜下腔出血后分别测定血pH值、PO2、PCO2和血糖水平，见表1。sham组兔术后无动物死亡，死亡率为0%；SAH组兔死亡率为41.1%(37/90)。

表1 各组动物一般生理状况比较

2.2脑组织含水量测定 大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织含水量较sham组(0.60±0.09)相比均明显升高，其中24 h后脑水肿达到高峰(0.85±0.13)，72 h后脑水肿有所下降(0.72±0.08)，但仍高于sham组(P<0.05)，6 h脑组织含水量为0.76±0.11。

2.3Western印迹分析自噬相关蛋白的表达变化 自噬相关蛋白在sham组呈现低表达，大鼠蛛网膜下腔出血后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较sham组明显升高。与LC3-Ⅰ的变化大致相仿，Beclin1和Atg5的表达在出血24 h后达到最高，与sham组相比有统计学差异(P<0.05)。见图1，表2。

2.4免疫组织化学检测自噬相关蛋白的表达 免疫组化结果见图2，自噬相关蛋白在sham组的脑组织中呈低表达，在蛛网膜下腔出血24 h后Atg5、Beclin1和LC3-Ⅰ的表达增高。表明蛛网膜下腔出血24 h后自噬蛋白在脑组织中表达明显升高。

图1 Western印迹分析蛛网膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I蛋白表达的变化

表2 Western印迹分析自噬相关蛋白的表达变化

与sham组比较：1)P<0.05

图2 免疫组织化学检测蛛网膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I在脑组织的表达变化(×40)

3 讨 论

目前研究发现，脑梗死脑组织中存在神经元自噬现象，具有神经保护作用。体外和体内脑缺血实验模型中，无氧状态下神经元在几分钟内就会死亡，中风后几分钟内无血区就发生神经元坏死。

在缺血坏死区的周围，神经元不能得到足够的血供的低灌注区被命名为“缺血半暗带”，而缺血半暗带被认为与延迟性神经元死亡有关〔5〕。在缺血半暗带中caspase-3 激活也有Beclin 1、LC3、BNIP3等自噬相关基因的激活，表明其中可能同时存在凋亡和自噬〔6,7〕。Xue 等〔8〕发现，细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶被阻抑后，细胞内的线粒体被选择性清除，从而缺血后自噬机制被激活，受损的线粒体被清除、凋亡终止，但线粒体的清除能够被 bafilomycin A1(BFA，一种自噬体和溶酶体融合的阻滞剂)阻断。目前被较多研究者接受的一个观点是，脑缺血首先启动凋亡路径，缺氧和内质网应激触发自噬体形成并清除受损的线粒体，阻断凋亡，通过异化能量生成保持细胞稳态，避免细胞坏死。然而如果脑灌注不足长时间得不到纠正，高度的“自噬应激”可导致大量溶酶体激活，最后细胞死亡〔9〕。而自噬可以有效地清除受损的细胞器和大分子，将大分子物质再循环以提供 ATP和合成新的大分子，保持细胞内的稳态和利于细胞生存。过度的自噬激活就会导致自噬性细胞死亡〔10〕。

Wen等〔11〕用MCAO模型研究局灶性缺血，发现缺血脑组织存在自噬体和自噬溶酶体，自噬抑制剂3-MA、BFA 和组织蛋白酶抑制剂预先在脑室内应用可以显著减少梗死体积、脑水肿及运动障碍。而且有研究显示蛛网膜下腔出血后存在自噬现象〔12〕。所以我们可以推测DCVS后可能会出现自噬现象。

目前关于细胞死亡的讨论有很多，最常见也被公认的有细胞坏死、细胞程序性死亡(细胞凋亡)、细胞自噬型死亡。自噬与凋亡不完全相同，他们两者之间的关系相对复杂，功能情况互相调控，在特定环境下，如体外应激，细胞自噬可以一定程度适应应激条件，抑制部分细胞凋亡，在其他细胞内的背景下，自噬性细胞死亡可以诱导非正常细胞的损伤〔13,14〕。在一般正常条件下，同样的应激条件对细胞凋亡和细胞自噬的诱导是无差别的，但是因为二者敏感阈值不同而导致其性质不同，二者的性质受胞内物质分解代谢水平的调节，在细胞内可同时存在自噬和凋亡，尽管多数情况下细胞通过适应应激，但是如果自噬严重，能够完全导致细胞死亡〔15〕。已有学者证明自噬可以被凋亡信号诱发，而且可以在凋亡过程中持续存在自噬现象，但是自噬能否完全独立地诱导细胞死亡还需要进一步探讨。在果蝇唾液腺中激活类固醇能诱导自噬小体〔16〕，水解caspase降低其活性可以抑制自噬的出现〔17〕，同时Beclin1上调可以提高caspase活性，进而诱导细胞凋亡〔18〕，这些都证明了自噬与凋亡在细胞死亡程序中扮演相似的重要功能。

细胞死亡是错综复杂的机制作用，本实验证实SAH后自噬激活存在于DCVS后的脑缺血中，而自噬在SAH发生过程中的具体机制尚需进一步探讨。

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Delayedvasospasminducedneuronalautophagythroughcerebralischemia

WANGZi-Zhen,YANGKun,ZHENGChuan-Yi.

DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo investigate the delayed vasospasm after cerebral ischemia-induced neuronal autophagy phenomenon.MethodsDelayed vasospasm after subarachnoid hemorrhage model rabbit brain was made, brain water content was detected to determine the extent of the success of the model. Neuronal cells in brain tissue necrosis, apoptosis and autophagy were detected by Western blot and immunohistochemistry. The expression of autophagy antibodies in rabbit brain model was detected by Western blot. The expression of autophagy protein in detection of vascular spasm region was detected by immunohistochemistry.ResultsThe model of rabbit was successful. Rabbit brain tissue showed neuronal necrosis, apoptosis and autophagy. Compared with before infarction, A the brain water content was increased fter infarction 24 h. Western blot immunohistochemistry confirmed vasospasm and delayed neuronal cells from an association between macrophages.ConclusionsThe presence of cerebral ischemia and neuron autophagy exist in the DCVS model, the degree of cerebral vasospasm is partly related to neurons autophagy.

DCVS; SAH; Autophagy

国家自然科学基金项目(No.81260371)；海南省自然科学基金项目(No.20158300)

杨 堃(1965-)，男，主任医师，博士，硕士生导师，主要从事脑胶质瘤的基础与临床研究。

王子珍(1966-)，男，副主任医师，主要从事神经外科疾病诊治研究。

R734.9

A

1005-9202(2017)23-5749-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.003

〔2017-01-15修回〕

(编辑 李相军/徐 杰)