浅低温对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

池 豪 杨东伟 刘新叶

(郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，河南 郑州 450007)

浅低温对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

池 豪 杨东伟 刘新叶

(郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，河南 郑州 450007)

目的探讨浅低温对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法将48只老年大鼠随机分为浅低温组和对照组，每组24只。对照组大鼠在37℃平衡灌流30 min，缺血30 min，再灌注120 min；浅低温组大鼠在37℃平衡灌流30 min，缺血30 min，34℃浅低温下再灌注120 min。检测心室线粒体和胞质细胞色素C水平，心肌组织中丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力及心肌梗死范围。结果浅低温组线粒体细胞色素C水平高于对照组(P<0.05)，胞质细胞色素C低于对照组(P<0.05)。浅低温组大鼠试验后心肌梗死面积低于对照组(P<0.05)。浅低温组大鼠心肌组织中MDA含量低于对照组(P<0.05)，ATP含量和SOD活力高于对照组(P<0.05)。结论浅低温对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与浅低温能够减少心室线粒体中细胞色素C的扩散、降低心肌组织MDA含量、升高心肌组织中ATP含量和SOD活力有关。

浅低温；心肌缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤是缺血性心脏病治疗后常见的病理生理现象，急性心肌梗死后冠状动脉旁路移植术、急性心肌梗死后溶栓术、体外循环条件下心内直视术等都经历心肌缺血再灌注过程，导致心肌缺血再灌注损伤。因此，减轻和预防心肌缺血再灌注损伤具有重要意义〔1〕。浅低温治疗是指将中心温度控制在合适范围的一种干预方法，对于院外心脏骤停成年患者可以给予持续12～24 h、32℃～35℃的低温治疗，对缺血再灌注损伤有保护作用〔2〕。老年患者机体伴随一系列的病理生理变化，如心血管功能减退、自由基生成增多、药物代谢改变、冷热敏感性增强、心肌收缩功能减弱、线粒体功能下降、细胞坏死和凋亡的敏感性增加等〔3〕。本文探讨浅低温对老年大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，分析其对缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：清洁级、健康、雄性、22～24月龄、体重345～555 g、老年Wistar大鼠48只，购自北京生命科学研究所，许可证号：SYXK(京)2015-0002。主要试剂：2，3，5-氯化三苯基四氮唑、抗细胞色素C单克隆抗体、抗小鼠IgG抗体(美国Sigma公司)，丙二醛(MDA)检测试剂盒、三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠分组及处理 将48只大鼠随机分为浅低温组和对照组，每组24只。对照组大鼠在37℃下平衡灌流30 min，缺血30 min，再灌注120 min；浅低温组大鼠在37℃下平衡灌流30 min，缺血30 min，34℃浅低温下再灌注120 min。

1.2.2制备离体心脏灌注模型 将大鼠麻醉成功后固定到大鼠手术台上，开胸取出心脏，并立即放入4℃预冷的灌流液中冷却使心脏停搏，然后挤出心脏瘀血，夹住主动脉断端提起心脏进行主动脉插管，以灌注液进行恒流灌注。浅低温组降温方法：将恒温循环水浴箱中加入冰块使水温降至34℃，然后保持恒温循环水浴箱温度恒定。

1.2.3细胞色素C水平测定 灌注结束时每组取8只大鼠分离心室，并分离心室部分的浆膜下线粒体和胞质，以抗细胞色素C单克隆抗体为一抗，碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体作为二抗，采用Western印迹法测定细胞色素C水平，计算与对照组光密度值的比值作为细胞色素C水平。

1.2.4心肌组织中MDA、ATP含量和SOD活力测定 每组取8只大鼠心肌组织加入蒸馏水制备成10%匀浆液，3 500 r/min离心15 min取上清液，测定心肌组织中MDA、ATP含量和SOD活力。

1.2.5心肌梗死范围测定 每组取8只大鼠，再灌注结束后取下心脏，生理盐水冲洗干净，抽取1 ml 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸缓冲液注入主动脉根部，在37℃恒温箱中孵育40 min，然后冷冻固定25 min，将心脏切成1 mm厚的切片，多聚甲醛固定，测定梗死区范围，采用Image-ProPlus图像处理软件计算各组大鼠心肌梗死范围。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1两组细胞色素C水平比较 浅低温组线粒体细胞色素C水平(2.12±0.35)显著高于对照组(1.00±0.02)(P<0.05)，胞质细胞色素C(0.42±0.13)显著低于对照组(P<0.05)。

2.2两组大鼠试验后心肌梗死面积比较 浅低温组试验后心肌梗死面积〔(34.26±2.97)%〕显著低于对照组〔(59.37±5.42)%，P<0.05〕。

2.3两组心肌组织中MDA、ATP含量和SOD活力比较 浅低温组心肌组织中MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，浅低温组心肌组织中ATP含量和SOD活力显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠心肌组织中MDA、ATP含量和SOD活力比较

3 讨 论

线粒体是对损伤比较敏感的细胞器，是细胞内合成ATP的主要场所，缺氧可以引起线粒体肿胀、自溶和崩解，可增加线粒体外膜的通透性，引起小分子物质扩散到胞质中，且线粒体形态的改变可引起线粒体功能障碍〔4，5〕。细胞色素C是一种水溶性小分子蛋白，位于线粒体内膜上，在线粒体膜的通透性增加时，细胞色素C容易从线粒体中扩散到细胞质中，细胞质中的细胞色素C可导致caspase蛋白活化，引起细胞凋亡；线粒体中细胞色素C减少时对呼吸链电子的传递有抑制作用，氧化磷酸化受到抑制使线粒体ATP生成障碍，从而导致细胞坏死〔6，7〕。本文发现浅低温可减少缺血再灌注损伤后心肌梗死面积，对心肌具有保护作用；缺血再灌注损伤可引起线粒体中细胞色素C水平降低，胞质中细胞色素C升高，考虑缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞线粒体中细胞色素C扩散到胞质中，从而引起线粒体功能障碍和形态变化，导致心肌损伤；而浅低温有减轻线粒体损伤的作用，从而对心肌具有保护作用。

心脏需要足够的能量维持正常的生理功能，是一个高耗能器官，缺血再灌注损伤的始动环节为心肌能量代谢障碍，心肌做功所需的主要能量来源为ATP，ATP的生成、利用在心肌功能中发挥重要作用〔8～10〕。氧自由基介导的脂质过氧化反应是缺血再灌注损伤的重要环节，在生理状态下产生适量的氧自由基可以维持正常的代谢过程，当组织出现缺血或者缺氧时，机体抗氧化功能丧失或降低，产生大量的氧自由基，出现脂质过氧化作用，从而引起细胞功能结构发生变化，引起心肌损伤〔11，12〕。MDA可以反映心肌细胞中脂质过氧化程度，可以根据MDA水平了解缺血再灌注损伤过程中的心肌细胞氧化损伤程度〔13〕。SOD是重要的抗氧化酶之一，是心肌组织中氧自由基的天然清除剂，SOD活性可以反映机体对氧自由基的清除能力〔14，15〕。本文中浅低温可以减少心肌细胞能量消耗，增加心肌细胞中ATP储备，从而提高缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中ATP含量，对缺血再灌注损伤发挥保护作用；浅低温可以有效提高缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中SOD活力，降低心肌组织中MDA含量，从而对缺血再灌注损伤发挥保护作用。

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R54

A

1005-9202(2017)23-5747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.002

河南省科技厅重点攻关项目(142102310460)

池 豪(1983-)，男，硕士，主治医师，主要从事冠心病的临床与介入诊疗研究。

〔2017-01-15修回〕

(编辑 徐 杰)