玉米单倍体加倍问题探讨

宋俊乔 孙海潮 张晓辉 卢道文 牛永锋 张莹莹 张 盼 董文恒 李永江

（安阳市农业科学院 河南安阳455000）

玉米是世界三大粮食作物之一，种植范围最广，其产量最大。 追求产量的增加仍是我国玉米育种重要任务之一， 利用杂种优势是玉米育种的最主要手段[1]。 纵观玉米育种进程，对于玉米育种方式方法的改进也是伴随玉米种质改良过程不可或缺的一个重要环节。 对于传统的育种方式，一个新品种的选育和审定至少需要10 年的时间，为了提高育种效率我们选择了分子标记辅助育种的技术， 只有分子标记初筛后具有目标性状的材料才会进入下一个育种环节，缩小了试验地的使用，提高了育种效率，使遗传增益（genetic gains）更加具有方向性，更加清晰。自从Randolph 和 Stadler 在 1929 年第一次报道了玉米单倍体[2]，玉米育种家对于单倍体育种方法的探索和改进就再也没有停止过。 玉米单倍体育种主要包括：单倍体诱导、鉴定和加倍三个环节，上篇文章已经对诱导和鉴定两个环节进行了详细阐释， 本篇文章会对单倍体加倍的相关内容进行有效的探讨。

1 单倍体加倍方法

选育出来的单倍体育种材料，含有一套染色体，因此单倍体的植株生长一般比较弱小， 叶片短而窄小，并且高度不育，不能直接应用于玉米遗传育种，只有经过加倍， 形成正常的双单倍体才能应用在育种和生产中。 目前单倍体加倍的方法一般有自然加倍与人工加倍。

1.1 自然加倍

单倍体植株在自然生长条件下， 不经过人为处理自发产生二倍体种子的过程，称为自然加倍。 单倍体在自然条件下进行自发加倍形成二倍体的概率比较低， 但是因为人工加倍的方法中主要采用的秋水仙素对人和环境都有危害， 所以育种学家又把精力转移到单倍体自然加倍的遗传改良上来。 单倍体的二倍化主要表现在雌穗结实性与雄穗的散粉性，任娇娇[3]等发现在单倍体育性恢复的过程中，雌穗与雄穗的育性恢复是2 个互相独立的过程， 因此在遗传研究中要加以区分对待。

1.1.1 雄穗育性恢复 Chase[4]研究表明，玉米单倍体可以产生自交结实，Khoklov 等[5]发现单倍体在没有经过物理或者化学因素处理下， 二倍体细胞也是存在于单倍体植株中，并认为这是自然加倍的结果。 吴鹏昊[15]认为在自然条件下，单倍体的自然加倍能力主要受限于雄穗的散粉性能， 不同遗传背景下的单倍体也存在不同程度的育性恢复， 有的是单个小穗或者几个小穗可以散粉，还有的达到整穗散粉，杨继伟等[6]认为这有可能和单倍体细胞的二倍化早晚程度有关系。 Chase[7]和魏俊杰等[8]对单倍体雄穗的自然恢复进行的研究结果表明， 如果自然恢复率达到10%左右， 不同基因型的变异系数可以达到50%。Shatskaya 等[9]研究也认为，单倍体雄穗的可育性程度也是遗传性状之一，不同来源的基因型单倍体雄穗，其育性恢复能力差异表现也很大。

1.1.2 雌穗育性恢复 刘志增等[10]也进行了自然恢复的相关研究， 单倍体雌穗的育性自然恢复率都可以达到 90% 以上。 Chalyk[11]利用马齿型玉米的234 个单倍体植株， 混合正常的二倍体花粉进行杂交和授粉，结实的果穗最高有127 粒，平均每一个果穗可以结实 26.6 个，只有 8 个果穗没有结实。任姣姣[12]用郑单 958 花粉对来源不同的 22 个自交系单倍体雌穗进行多次授粉， 由此来分析单倍体雌穗的育性恢复能力，研究结果表明，单倍体雌穗的平均结实株率可以达到 89.54%。 由此可见， 单倍体雌穗自然恢复为二倍化的能力高于雄穗。 多项研究结果表明，单倍体雌穗的育性自然恢复能力决不是限制单倍体自然加倍的主要因素。

1.1.3 育性恢复的分子研究 吴鹏昊研究结果表明在自然条件下， 生殖细胞与体细胞存在倍性转化现象[13]，但是雌穗结实率较高，单倍体的二倍化主要表现在雌穗结实性与雄穗的散粉性， 单倍体自然加倍能力受限于雄穗散粉的性能，这与Chalyk[14]的研究结果基本相同。 育种家认为玉米单倍体的雄穗育性恢复能力和遗传因素有着显著相关性。 深入进行单倍体雄穗育性恢复的遗传研究， 控制单倍体雄穗的育性恢复主效QTL 是提高单倍体进行自然加倍效率的关键因素之一。 吴鹏昊[15]利用Fm 群体对单倍体雄穗的育性恢复性状进行定位， 检测到有六个位点分别位于 1，3，6，9，10 号的染色体上。 由于双亲在雄穗的育性恢复性状上差异相对较小， 由此得到的QTL 位点效应值都比较低。 任娇娇等用髙频单倍体雄穗育性恢复自交系豫87-1 和4F1 分别与低频育性恢复自交系郑58 构建不同遗传背景的单倍体群体，研究结果发现在“豫87-1／郑58”群体定位到4 个与单倍体雄穗育性恢复相关的QTL 位点， 分别位于玉米第1、3、4 和 6 号染色体上。 其中位于 6 号染色体的 4 个位点在两个群体中偏分离表现最显著， 因此该片段被认为是雄穗育性恢复非常关键的位点。

马海林[16]通过对500 份玉米材料组成的自然群体进行诱导， 对所得到的单倍体进行两年自然加倍率的评价，结合50 k SNP 芯片的基因分析，利用全基因组关联分析手段，检测到有22 个与单倍体自然加倍相关的SNP 位点，但每个位点的效应值也比较低，只有位于六号染色体上的3 个连续的SNP 位点最高，但也只有6%。 Sugihara 等[17]通过物理诱导方法，用叠氮化钠对玉米自交系B55 的种子进行处理，然后再与诱导系RWS 进行杂交，其自然加倍率能够显著提升。

1.2 化学加倍

通过自然加倍可以获得少量的玉米双单倍体籽粒， 但因为雄穗育性恢复率太低而导致自然加倍率太低，用化学加倍方法对玉米单倍体进行加倍，可以提高单倍体的育性恢复效率。 目前在单倍体加倍上最常用的药剂是秋水仙素。 秋水仙素与微管蛋白相结合，可以抑制微管形成，使染色体加倍。 应用秋水仙素进行化学加倍的方法大致有浸种法、注射法、浸根法和浸芽法4 种。

1.2.1 浸种法 用秋水仙素处理种子前后需要用清水浸泡。 处理前用清水浸泡12 h， 然后再用浓度为0.6 mg/mL 的秋水仙素浸泡种子24 h，之后再用清水冲洗种子6 h，这样发芽率通常能够达到85%~90%，种子发芽率随着遗传背景不同也会有所不同[18]。

1.2.2 浸根法 这种方法适用于对已经发芽的单倍体或者单倍体幼苗。 对单倍体幼苗在三叶期时用0.15%的秋水仙素浸泡3 h， 其单倍体雄性育性恢复率可以达到30%~60%之间。 徐国良等[19]采用浸根法对3 叶期单倍体的根部进行处理，研究结果表明，浓度为0.02%秋水仙素浸泡加倍效果最高。

1.2.3 浸苗法 最高效的浸苗法是Deimling[20]在Gayen 等[21]提出的方法上经过改进形成，将幼苗根部切除20~30 mm， 在黑暗中将处理过的幼苗浸泡在0.06%的秋水仙素溶液中12 h， 然后在温室中种植，到5~6 叶期再移到田间。 Eder and Chalyk[22]将这个方法应用在多个不同遗传背景的玉米材料中， 平均加倍效率高达49%。

1.2.4 浸芽法 将单倍体种子发芽后， 切掉芽尖1～2 mm， 在 浓度为0.06%~0.08%的秋水仙素和 2%的二甲基亚砜混合溶液中浸泡8~12 h， 再用清水冲洗1~2 h。

1.2.5 注射法 秋水仙素的浓度， 注射量和注射植株的部位成为能否加倍成功的制约因素，Chase[23]用0.05%的秋水仙素溶液和10%的甘油注射单倍体根尖，结实率可以提高3 倍。Eder 等[22]对幼苗用0.125%的秋水仙素溶液和0.05%的DMSO 注射， 其结实率可以达到8.1%。 刘志增等[24]研究发现用0.1%的秋水仙素溶液在幼苗六叶期进行注射效率最高。

1.2.6 其他试剂 秋水仙素是一种毒性药剂， 如果操作不当或长时间使用可能会导致人中毒，因此，选择替代品来进行加倍就显得十分重要。 吲哚乙酸、生长素等植物生长调节剂，磺胺剂、藜芦碱及麻醉剂等次级代谢产物以及有机砷、 有机汞等物质也能诱导染色体加倍。 一些除草剂类物质（如磷酰胺、苯基酰胺、氟乐灵、氨磺乐灵、拿草特等）也可使植物的染色体加倍[25]。 Wan[26]等用拿草特、甲基胺草磷、氟乐灵和安磺灵这 4 种药剂对玉米的愈伤组织进行处理后，也得到了加倍植株。慈佳宾[27]等人用氟乐灵和拿草特两种除草剂研究表明， 这两种药剂也具有加倍的效果。 惠国强[28]等人对炔苯酰草胺、甲基胺草磷和氟乐灵等加倍药剂的研究也发现这3 种药剂可以提高单倍体加倍效率。

1.2.7 物理加倍方法 利用物X 射线， 中子辐射等物理方法也可以加倍单倍体， 但加倍效果不理想。Kato[29]发现 N2O 也具有加倍功能，在小麦等作物上成功应用。

2 影响单倍体加倍的因素

2.1 影响自然加倍的因素

2.1.1 遗传因素的影响 自然加倍包括雄穗自然加倍和雌穗自然加倍， 其中单倍体雌穗育性恢复率可达90.52%， 影响单倍体加倍率的限制性因素主要是雄穗育性， 所以文章主要讨论遗传因素和非遗传因素是对雄穗育性恢复的影响。

自然加倍效率在同一作物不同基因型的材料中浮动都较大[30]，尤其是对于玉米，随着遗传背景不同，其自然加倍效率有着很大差异。 Kleiber 等[31]对大约200 份玉米种质材料进行了单倍体自然加倍能力的研究，研究结果表明，温带骨干种质材料比温带地方种质的自然加倍效率要高， 早熟品种比晚熟品种的自然加倍效率要高。

2.1.2 非遗传因素的影响法 Kleiber[31]对不同材料在大田环境和温室环境下进行单倍体自然加倍效率研究发现， 相同材料在温室环境下是在大田环境下的3 倍。 国内公认的比较好的单倍体自然加倍地点是海南[32]和甘肃[33]。吴鹏昊[34]通过研究发现，海南和甘肃这两个地区的整体气温比较稳定， 在单倍体散粉时期不会遭遇较高温度，并且还会具有一定温差，这对植物生长发育非常有利。

2.2 影响化学加倍的因素

2.2.1 处理时期 处理的植物组织必须是在植物细胞分裂最旺盛的时期， 困此用化学加倍必须是在浸泡种子之后，或者生根发芽，或者幼株时期进行加倍处理才可以达到加倍的效果。

2.2.2 操作方法 用秋水仙素对玉米单倍体加倍的最佳浸泡时间在10 h 左右，而造成不同加倍效果的原因是由秋水仙素药剂的温度、浓度以及种子自身生命状态决定的。 有关试验结果表明，当浓度为0.8 mg/mL时，加倍率最高，极显著高于其他浓度。曹孜义[35]等人研究表明，在11℃～17℃低温下对单倍体进行秋水仙素处理，然后在25℃常温下让植物生长，可有效提高单倍体加倍率。

2.2.3 除草剂（替代剂）使用 单倍体的自然加倍率太低，而秋水仙素毒性强，使用不当对单倍体苗、人和环境均可产生危害[36]。有学者在研究中发现甲基胺草磷在浓度为80 μmol/L 加倍效果最好，可达到30%的加倍率，这与慈佳宾等[37]、惠国强等[38]和王贺等[39]的研究结果相一致。 张良君等研究结果表明, 浓度为100 μmol/L 的 APM 滴心法加倍率最好[40]。 陈宝建等研究发现APM 在浓度为1 μmol/L 时处理单倍体幼胚 72 h， 其成株散粉率最高， 可以达到 37%[41]，其APM 处理的浓度低于程江等[42]研究中的80 μmol/L，这是因为幼胚对APM 的耐受性要低于种子和幼苗。

2.2.4 二甲基亚砜 白守信等[43]研究表明，二甲基亚砜可以有效地提高单倍体加倍的频率，李志武等[44]研究发现，加入浓度为1%～3%的二甲基亚砜有助于提高小麦染色体加倍。 加入浓度为2%～5%的二甲基亚砜，也有助于提高玉米单倍体加倍效率。

2.2.5 生长环境 良好的生长环境也是提高单倍体加倍率的重要因素之一。 因此在用化学药剂处理单倍体后，应立即用大量清水冲洗6 h，加强田间管理也是决定单倍体能否成活的重要原因。

玉米是世界第一大粮食作物， 而玉米科研育种时间紧、任务重，只有选育出优良玉米自交系才可以选育出优良的玉米杂交种。 单倍体加倍育种技术可以缩短育种年限，快速获得纯合的优良玉米自交系。单倍体育种也是目前被广泛应用的现代高效育种技术和育种方法。 自然加倍和化学加倍都存在致命的硬伤，自然加倍的加倍率非常低，化学试剂的使用虽然可以有效提高加倍率，但对人、牲畜和环境都有一定危害。 所以如何进行单倍体加倍方法的优化和提高单倍体效率， 是现在单倍体育种面临的一个非常重要的难题。