宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

刘桂杰，倪腾凤

宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

刘桂杰1，倪腾凤2

目的：检测宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌体外培养生物膜的抑制作用，探讨其抗菌机制。方法：体外培养表皮葡萄球菌产膜菌株，使用半定量粘附实验结晶紫染色法及刚果红实验检测，评估宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用。宁泌泰胶囊处理后，检测表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受及抗生素敏感性（最小抑菌浓度）的变化，并通过实时荧光定量PCR检测氧化应激响应基因serp2195和gpxA-2转录水平变化。结果：结晶紫染色法显示，宁泌泰胶囊能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成（P＜ 0.001），刚果红实验结果与此一致。在宁泌泰胶囊20 mg/mL浓度条件下，表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受性减弱了8倍，对氯霉素及红霉素敏感性均增强了4倍；实时荧光定量PCR显示，与阴性对照组相比氧化应激响应基因serp2195和gpxA-2转录水平分别降低至22.9%和24.5%。结论：宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜具有显著抑制作用，减弱细菌对氧化胁迫耐受性，其机制可能通过下调表皮葡萄球菌氧化应激响应基因serp2195和gpxA-2表达水平实现；同时宁泌泰胶囊可以减弱表皮葡萄球菌对抗生素耐药性。

宁泌泰胶囊；表皮葡萄球菌；生物膜；氧化胁迫；细菌耐药性

慢性细菌性前列腺炎致病因素主要为病原体感染，以逆行感染为主，病原体主要为葡萄球菌属，其次为大肠埃希菌、棒状杆菌属及肠球菌属等[1]。生物膜是病原体持续存在和感染复发的重要原因[2]，细菌具有高度耐药性的同时还能逃避免疫系统的攻击，危害性严重[3]。表皮葡萄球菌具有显著形成生物膜的能力，是前列腺炎重要致病菌之一[4]。宁泌泰胶囊广泛应用于治疗下尿路感染、慢性前列腺炎，具有明确的抗菌作用[5-6]。本研究通过对体外表皮葡萄球菌生物膜测定，观察宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的作用，检测表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受及抗生素敏感性的变化，为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基 产膜菌株表皮葡萄球菌SE1457，培养基为胰蛋白胨大豆肉汤TSB（英国OXOID 公司）。

1.2 试剂 结晶紫购于生工生物工程(上海)股份有限公司，过氧化氢液购于Sigma公司，氯霉素和红霉素购于大连美仑生物技术有限公司，宁泌泰胶囊购于贵阳新天药业股份有限公司。总RNA提取试剂盒购于德国Qiagen公司，逆转录聚合酶链反应试剂盒购于日本Takara公司，实时荧光定量PCR试剂盒购于日本东洋纺绩株式会社。

1.3 结晶紫染色法检测生物膜形成 根据Chrietensen等方法略作改动[7]。表皮葡萄球菌使用TSB培养基培养至对数中期，按1:1000比例稀释（实验组将宁泌泰胶囊用无菌TSB培养基配制成系列浓度稀释液，即20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL 3组，无菌滤膜过滤除去未溶解成份；阴性对照组加入同等体积的生理盐水），滴加至无菌的96 孔板中（200 μL/孔），5个复孔，37 ℃恒温箱中静置培养24 h。用移液枪小心弃除培养液，无菌的磷酸盐缓冲液PBS（200 μL/孔）洗去未粘附菌，重复洗涤3次。干燥，加入99%甲醇（200 μL/孔），固定15 min 。弃去液体，室温干燥。加入2%结晶紫（200 μL/孔），孵育20 min。去离子水轻轻冲洗干净未结合的结晶紫，在酶标仪上以570 nm波长测定吸收值A。

1.4 刚果红实验检测生物膜形成 根据Arciola[8]等方法配制刚果红培养基（刚果红0.8 g/L，脑心浸液干粉37 g/L，蔗糖36 g/L，琼脂粉20 g/L），实验组使用过滤后的宁泌泰胶囊水溶液（浓度梯度设置为20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL）溶解上述成分；阴性对照组使用去离子水溶解。表皮葡萄球菌使用TSB培养基培养至对数中期，刚果红平板划线培养，37 ℃恒温箱静置24 h，菌落形成后室温培养24～72 h。观察记录细菌菌落颜色，生物膜阳性细菌菌落为黑色，生物膜阴性细菌菌落为红色[8]。

1.5 表皮葡萄球菌对过氧化氢及抗生素敏感性测定 实验组为无菌TSB培养基溶解宁泌泰胶囊配制成的系列浓度稀释液，阴性对照组加入同等体积的生理盐水。各培养基中加入过氧化氢或抗生素，以倍比稀释法稀释，滴加至96 孔板中（50 μL/孔）。表皮葡萄球菌使用TSB培养基培养至对数中期，分别以实验组或对照组培养基按1:1000比例接稀释，滴加至96 孔板中（50 μL/孔），37 ℃恒温箱中静置培养24 h。观察记录细菌存活情况。1.6 表皮葡萄球菌基因转录水平检测 表皮葡萄球菌使用TSB培养基培养至对数中期后，按1:1000比例稀释，接种至含宁泌泰胶囊（浓度梯度设置20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL 3组）的TSB培养基中，阴性对照组为不加入宁泌泰胶囊的TSB培养基。37 ℃ 培养6 h，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA。cDNA合成按照逆转录聚合酶链反应试剂盒方法操作。使用荧光实时定量PCR检测宁泌泰胶囊处理前后相关基因转录水平。按照实时荧光定量PCR试剂盒操作，内参基因采用gyrB（引物 5引物B因采用BIRD SYBR qRTPCR Kit 5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'）；目的基因检测serp2195（引物5'-CCATTTGTCTTCCG AATGGT-3'/5'-GCCCATATCCTTGGATTGAA-3）及gpxA-2（引物5'-TTTGCGAACCAAATAATCC TG-3'/ 5'-TGAGCTTCCCTTGCAATGAT-33）表达变化[9]。

2 结果

2.1 对表皮葡萄球菌生物膜的作用 与阴性对照组相比，宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌体外培养生物膜具有抑制作用，且呈现出浓度梯度依赖性。宁泌泰胶囊在5.0 mg/mL浓度条件下能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成（P＜ 0.001），而浓度的升高进一步增强了这种抑制作用。图1为结晶紫染色检测表皮葡萄球菌胞外粘附基质的半定量粘附实验结果。

图2为刚果红实验检测表皮葡萄球菌胞外粘质物实验结果。阴性对照组表皮葡萄球菌生物膜形成能力显著，细菌菌落为明显的黑色。宁泌泰胶囊5.0 mg/mL浓度条件下，部分表皮葡萄球菌菌落呈现黑色及生物膜阳性（黄色箭头所示），部分菌落颜色则呈现红色生物膜阴性（绿色箭头所示），表明细菌生物膜形成受到部分抑制。而宁泌泰胶囊等于及高于10.0 mg/mL浓度条件下，菌落颜色几乎全部为红色，显示表皮葡萄球菌生物膜形成受到明显抑制。

图1 结晶紫染色检测细菌胞外粘附基质

图2 刚果红实验检测表皮葡萄球菌生物膜

2.2 减弱表皮葡萄球菌对过氧化氢的耐受 如表1所示，减号代表细菌生长受到抑制，加号代表细菌生长未受到抑制。阴性对照组在没有加入宁泌泰胶囊时（0 mg/mL），表皮葡萄球菌对过氧化氢液耐受程度为 4.4～8.8 μ M。加入宁泌泰胶囊后，表皮葡萄球菌对过氧化氢液耐受降低。在宁泌泰胶囊20 mg/mL浓度条件下，表皮葡萄球菌对过氧化氢液耐受降低为0.55～1.1 μM，对氧化胁迫耐受性减弱了8倍。

表1 表皮葡萄球菌对过氧化氢的耐受性

宁泌泰胶囊浓度在10 mg/mL时，serp2195和gpxA-2转录水平分别降低为57.9%和64.0%；宁泌泰胶囊浓度在20 mg/mL时，serp2195和gpxA-2转录水平分别降低为22.9%和24.5%。这表明宁泌泰胶囊通过下调氧化应激响应基因的表达，增强了表皮葡萄球菌对氧化胁迫的敏感性。见图3。

图 3 氧化应激响应基因serp2195和gpxA-2转录水平

2.3 增强表皮葡萄球菌对抗生素的敏感性 阴性对照组在没有加入宁泌泰胶囊时（0 mg/mL），氯霉素和红霉素对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为20 μ g/mL和1.25 μ g/mL。加入宁泌泰胶囊后，表皮葡萄球菌对抗生素敏感性增强。在宁泌泰胶囊20 mg/mL浓度条件下，表皮葡萄球菌对氯霉素和红霉素最小抑菌浓度分别为5.0 μ g/mL和0.32 μ g/mL，即对两种抗生素敏感性均增强了4倍。见表2。

表2 抗生素对表皮葡萄球菌最小抑菌浓度

3 讨论

细菌生物膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物，犹如一个“菌巢”[10]。在细菌性前列腺炎中，细菌的生物膜在下尿路感染的发生发展过程中发挥了重要作用[11-12]。Bartoletti研究报道，慢性细菌性前列腺炎病人常见病原体为产膜细菌，显著减弱了临床抗生素治疗的效果[12]。Kanamaru则证实，细菌性前列腺炎和细菌生物膜之间存在明确联系[13]。Mazzoli评估了从NIH-II型前列腺炎病人身上分离得到的150种细菌菌株产膜能力[14]，结果发现大多数的大肠杆菌（93%）、革兰氏阴性菌杂集（90%）、葡萄球菌属（80%）、肠粪球菌（72%）为中高度产膜菌株。因而针对细菌生物膜的治疗，日益引起前列腺炎和下尿路感染临床用药的重视。

宁泌泰胶囊为经典苗药，组方选择四季红、大风藤、连翘、三棵针、仙鹤草、木芙蓉叶、白茅根，运用现代制药技术精制而成的纯天然中药制剂，多种单体化合物成分已被证实具备抑制生物膜的作用。没食子酸对大肠杆菌和变异链球菌生物膜形成具有抑制作用[15]，槲皮素能够显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成[16]。木犀草素能够减弱尿道致病性大肠杆菌粘附和侵袭，抑制其生物膜形成[17]。连翘中连翘苷对表皮葡萄球菌生物膜形态有显著影响，显微镜下观察，连翘苷可使部分表皮葡萄球菌被膜的形态发生改变[18]。小檗碱通过酚可溶性调控蛋白抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜形成，并增强了细菌对抗生素的敏感性[19]。儿茶素则能够抑制变异链球菌生物膜形成[20]。综上所述，宁泌泰胶囊具备抑制细菌生物膜的潜能。

本实验分别通过半定量粘附实验结晶紫染色法和刚果红实验证实，宁泌泰胶囊能够抑制表皮葡萄球菌体外培养的生物膜，具有浓度梯度依赖性。表皮葡萄球菌生物膜受到抑制后，必将更容易受到宿主免疫系统的攻击。宿主消灭细菌的重要途径为对病原体产生氧化胁迫，过氧化氢是其中的一种主要形式。本文使用过氧化氢液模拟氧化胁迫，证实表皮葡萄球菌生物膜在受到宁泌泰胶囊抑制后，对过氧化氢液耐受明显下降。表皮葡萄球菌中基因serp2195编码二氢硫辛酰胺脱氢酶，基因gpxA-2编码谷胱甘肽过氧化物酶，这两个蛋白酶能够还原过氧化物消除氧化压力，在受到氧化胁迫时基因转录水平明显升高[9]。宁泌泰胶囊减弱表皮葡萄球菌对氧化胁迫的耐受，其机制可能通过下调氧化应激响应基因serp2195和gpxA-2表达水平实现。这两个基因已被证实受生物膜形成相关基因abfr调控[9]，而宁泌泰胶囊抑制生物膜形成，是否通过影响abfr功能进而调控serp2195和gpxA-2表达尚需进一步深入研究。与此相对应，表皮葡萄球菌对相关抗生素敏感性增强。临床上也有大量的研究证实，宁泌泰胶囊联用抗生素在尿路感染及前列腺炎等疾病治疗中，效果优于单用抗生素[21]。对细菌生物膜的抑制，为宁泌泰胶囊临床应用提供了重要的科学依据，但细菌生物膜受到抑制的具体环节和途径尚需进一步深入研究。

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统计学方法记述要求

统计学符号一律按GB 3358-1982《统计学名词及符号》的有关规定，采用斜体排印。常用的符号有：(1)样本的算术平均数x(中位数仍用M)，(2)标准差用s，(3)标准误用sx，(4)t检验用t，(5)F检验用F，(6)卡方检验用希文小写χ2，(7)相关系数用r，(8)自由度用希文小写υ，(9)概率用P。对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料特点和分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件及分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用χ2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析；对具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系做出全面、合理的解释和评价。统计学方法的记述不能笼统记录为SPSS或SAS软件，而应写明所用统计学方法的具体名称，如：成组设计资料均数比较的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等，必要时给出统计量的具体值（如：t=4.35，χ2=5.33，F=12.09等）；在用不等式表示P值时，一般情况下选用P＞0.05、P＜0.05和P＜0.01 3种表达方式，无须再细分。当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）时，在给出显著性检验结果的同时，再给出95%可信区间。

Inhibition of Ningmitai Capsule on Biofilm Formation of Staphylococcus Epidermidis

LIU Gui-jie, NI Teng-feng Shanghai Haitian Medical Technology and Development Limited Company, Shanghai (200023),China

ObjectiveTo observe the effect of Ningmitai capsule on biofilm formation of Staphylococcus epidermidis, and to explore the possible anti-microbial mechanism of Ningmitai capsule.MethodsBiofilm of Staphylococcus epidermidis was prepared in vitro. The effect of Ningmitai capsule on the biofilm-forming ability of Staphylococcus epidermidis was evaluated via 96-well cell culture microtiter plates with crystal violet staining as well as Congo red experiment. Then the change of tolerance to oxidative stress and sensibility to antibiotics for Staphylococcus epidermidis being treated by Ningmitai capsule was measured. qRT-PCR analysis was performed to show the relative transcript level ofserp2195andgpxA-2upon Sepidermidis strain exposed to Ningmitai capsule at different concentrations.ResultsNingmitai capsule significantly prevented biofilm formation in Staphylococcus epidermidis (P＜ 0.001) during crystal violet staining and Congo red experiment. Under the concentration of 20 mg/ml, Ningmitai capsule weakened the tolerance of Staphylococcus epidermidis towards oxidative stress for 8 fold. Similarly, Ningmitai capsule enhanced the sensibility of Staphylococcus epidermidis towards both chloramphenicol and erythromycin for 4 fold. Further study showed that Ningmitai capsule could downregulate the transcript level ofserp2195andgpxA-2to 22.9% and 24.5%, compared to the negative control respectively.ConclusionDue to the inhibition on biofilm formation, Ningmitai capsule can reduce bacterial drug resistance and work in synergy with other antibiotics in urinary tract infections and chronic prostatitis caused by biofilm-producing bacteria.

Ningmitai capsule; staphylococcus epidermidis; biofilm; oxidative stress; bacterial drugresistance

R285.5

A

1007-6948（2017）06-0638-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.06.015

1.上海海天医药科技开发有限公司（上海 200023）

2.中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室（上海 201203）

倪腾凤，E-mail：nitengfeng@163.com

（收稿：2017-08-16 修回：2017-11-10）

张亚强 刘洪斌）