蛋白鲜味肽调味品生产工艺初探

王 虹，刘 鑫，李佳妮，邹晓霜，王 欢，齐宝坤，王中江，江连洲

(1黑龙江珍选食品有限公司，哈尔滨 150060；2东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

蛋白鲜味肽调味品生产工艺初探

王 虹1，刘 鑫1，李佳妮2，邹晓霜2，王 欢2，齐宝坤2，王中江2，江连洲2

(1黑龙江珍选食品有限公司，哈尔滨 150060；2东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

蛋白二次酶解技术生产蛋白鲜味肽能够在保有传统鲜味的同时，有效提高蛋白质得率，利于人体吸收。试验根据不同水产品的呈味特点，选择沙丁鱼和对虾为实验原料，利用复合蛋白酶对原料进行初步定向酶解并超滤，制备具有独特风味的短肽。采用响应面法优化酶解水产蛋白工艺，水解度作响应值，以探究酶添加量、酶解温度、时间及pH值对鲜味肽得率的影响，得到初步酶解制备鲜味肽最优工艺条件：复合蛋白酶加酶量3.3%、温度57℃、酶解时间3.5h、pH为7.1。

鲜味肽；酶解；超滤

现今国民的饮食趋势正逐渐发生转变，出于对口味及安全等角度考虑[1]，制备易于存放携带、天然健康而又风味多样的复合调味料更易受到消费者亲睐[2]。在国外调味料领域中，复合调味料占据了80%多的市场份额，而国内复合调味品市场将同样具有无限商机与巨大潜力[3]。

鲜味肽在保有其他味觉条件不被破坏的情况下，还可提升各自的呈味风味，所以鲜味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[4]。对虾及沙丁鱼中均含丰富蛋白质及营养物质[4-5]，是用于制备蛋白鲜味肽的优选食材。我国在呈味肽的理论及应用探究领域存在一定局限，复合调料也存在食用品质差、风味失真等缺陷[6]。迄今，采用酶技术对海鲜进行水解以制取鲜味肽的常用手段有单一酶解法、复合酶解法及定向分段酶解法[7]。由于单一酶解及复合酶解技术都存在各自的不足而会限制底物酶解程度[8]。故实验拟探究采用复合蛋白酶及风味蛋白酶双酶定向分段酶解底物[6，9]的最优工艺，因而试验初期，需探究二次酶解的前期阶段，即仅添加复合蛋白酶进行酶解的最佳工艺参数，使蛋白颗粒能够被有效水解为肽片段，有助于后期加入风味复合酶而实现第二阶段有效酶解[10]，如此可在保证传统鲜味的同时，提高蛋白质得率，便于人体吸收[9，11]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1材料 对虾、沙丁鱼，市售；复合蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶，诺维信(中国)投资有限公司；浓硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基红、溴甲酚绿，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.1.2仪器与设备 Mettler Toledo分析天平，上海衡平有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，上海一恒有限公司；F-4500型荧光分光光度计，日本Hitachi公司；GL-25MS 超速高速冷冻离心机，上海盛析仪器设备有限公司；超滤装置，无锡赛普膜科技发展有限公司；KND2C型定氮仪，上海纤捡仪器有限公司；数显台式酸度计，上海浦春计量仪器有限公司；旋转蒸发干燥仪，上海亚荣有限公司；PF6 原子荧光仪、TSA-986 原子吸收仪，北京普析有限公司；FDU-1200冷冻干燥机，日本东京Rikakikai公司；L-8900氨基酸分析仪，日本日立高科技有限公司；mersham蛋白质纯化系统，美国曼德公司；Superdex peptide 10/300 GL分析柱，美国上海诺磁公司。

1.2 试验方法

1.2.1酶解提肽方法 将原料进行解冻后粉碎，加入复合蛋白酶酶解3h，离心得上清液，取上清液备用，留待风味蛋白酶二次水解。

1.2.2酶解工艺流程[12]原料→解冻→粉碎→虾鱼酱→混合液→复合蛋白酶水解→灭酶→离心→过滤→取上清液→备用。

1.2.3基本指标测定 总氮量依据GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》方法测定[13]，氨基态氮含量根据ZBX 66038—1987《基态氮测定法》方法进行测定[14]。水解度的测定如式(1)所示，用以表征底物蛋白中被水解肽键数占肽键总数的百分含量[15]。

(1)

1.2.4响应面试验设计 在单因素试验基础上，确定复合蛋白酶酶解鲜味肽各单因素中合适的水平值范围，根据响应面中心组合及试验设计[16-17]，以探究各单因素参数对响应值的影响[18]。各酶解工艺参数酶添加量x1(%)、酶解时间x2(h)、酶解温度x3(℃)及酶解pH值 x4作自变量，蛋白水解率作响应值[19](表1)。

表1 因素水平编码

1.2.5酶解液多肽分子量分布 取离心后酶解液上清液，通过Amersham 蛋白纯化系统，Superdex peptide 10/300 GL分析柱，在洗脱液0.25 mol/L氯化钠、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液、pH 7.2、进样体积50 μL、检测波长214 nm、流速0.5 mL/min条件下[20]，进行酶解液多肽分子量分布测定。

1.2.6酶解液中氨基酸含量[21]称取一定质量样品置于玻璃水解管，随后加入6 mol/L HCl，抽真空并封管。使用水解器于110℃下进行24h水解。转移定容后过滤，得滤液加以干燥成固态，样品溶解于0.02 mol/L HCl并调整到合适浓度，利用氨基酸分析仪进行氨基酸类型与组成成分分析[22-23]。

2 结果与分析

2.1 试验材料的基本成分测定

试验材料成分见表2。

表2 试验材料成分

2.2 最佳用酶的筛选

加酶量2%、酶解6h，根据不同酶的特性，选择适宜的温度和pH，以1∶3的料液比，以TCA可溶性氮的浓度来检测不同酶的酶解效果。由图1可知，5种酶均在最适宜的条件下作用，复合蛋白酶的水解能力较显著[24]，水解度高达45%，综合考虑，选择复合蛋白酶作为分段酶解中第一段的酶制剂。

图1 不同酶对可溶性氮酶解效果

2.3 复合蛋白酶酶解工艺参数

通过单因素试验对复合蛋白酶作用时间、酶添加量、pH及温度等工艺参数的优化[25]，确定复合蛋白酶酶解的最适条件。

2.3.1复合蛋白酶酶解单因素试验

(1)加酶量对酶解效果的影响：由图2可知，在料液比调整为1∶10、酶解pH值7.5、作用时间3 h、温度55°C水解条件下，水解度的变化趋势呈现为先增加后降低。加酶量为3%时水解度最高，随后加酶量虽有增加，但水解度并无上升趋势，因此酶添加量选择3%为宜。

图2 加酶量对酶解效果的影响

(2)酶解时间对酶解效果的影响：由图3可知，在料液比1∶10、pH值为7.5、加酶量为3%、温度为55℃的水解条件下，水解度的变化趋势为先升高后降低。时间为3 h时水解度最高，此后，虽增加酶解时间对水解度也并无明显作用，故复合酶作用时间以3 h为最适。

图3 酶解时间对酶解效果的影响

(3)温度对酶解效果的影响：由图4可知，在料液比1∶10、pH值为7.5、加酶量为3%、时间为3h时，随着水解温度的增加，水解度呈现出先升高后降低的趋势。考虑到水解效果及节约能耗，酶解温度以55℃最佳。

图4 酶解温度对酶解效果的影响

(4)pH对酶解效果的影响：由图5可知，在料液比1∶10、温度为55℃、加酶量为3%、时间为3 h水解条件下，水解度的变化趋势为先升高后降低。pH值为8时水解度最高。

图5 pH对酶解效果的影响

2.3.2响应面法优化酶解条件

(1)复合蛋白酶酶解鲜味肽的响应面试验：以单因素试验为基础，依照Box-Behnken响应面法的试验要求，开展多组试验(表3)。利用Design Expert软件，以加酶量、酶解作用时间、温度及pH作自变量，以蛋白的水解度作相应指标进行回归分析，获取预测模型如式(2)：

Y=44.64+2.19X1+0.097X2-1.61X3-1.67X4+0.58X1X2-0.11X1X3-1.41X1X4+0.93X2X3+0.32X2X4+3.93X3X4-2.43X12-4.29 X22-3.10X32-3.24X42

(2)

表3 响应方案及结果

表4 回归与方差分析结果

表5 响应面寻优结果

(2)因素间的交互作用：由表5可知，交互项x3×x4对水解率的影响效果极为显著，重点分析交互项BC对水解度(Y)的影响，固定模型中的加酶量x1=3%和酶解时间x2=3h，x3×x4交互作用的三维曲面图与等高线图见图6。酶解温度在逐步增加的过程中，水解度出现了先上升后降低的情况，且随pH值增加，水解度也呈现先增加后减小的趋势，这是由于随着温度及pH的改变，在酶最适合的温度和pH范围内酶的活力达到最大，酶解越来越充分，呈鲜味的小分子短肽越来越多，当温度继续上升或pH超过最适值后，酶活力便会下降，酶解程度降低，水解程度也呈现出降低的趋势。

图6 交互项x3×x4对水解度的影响

2.3.3酶解液中多肽分子量分布的测定结果 研究表明，分子量较小的肽对食品的风味有较大的影响。由图7可见，一次酶解液中多肽主要集中在3 000～5 000 Da以上，占到44.15%，大于10 000 Da肽段的比例最低，为4.67%。由此可知，通过复合酶水解能较好地降解海鲜中分子量大于10 000 Da的片断，酶解产物中分子量主要分布在3 000～5 000 Da，使大分子量的肽分解成寡肽的转化率更高，更有助于鲜味的体现。

图7 一次酶解液的肽分子量分布(%)

2.3.4最佳条件下酶水解液中氨基酸的含量测定 表6表明，一次水解液的氨基酸含量丰富。

表6 酶解液内氨基酸种类及含量

3 结论

本试验确定复合蛋白酶初次酶解生产鲜味肽的最佳工艺参数为复合蛋白酶初次添加量3.3%、酶解温度57℃、酶解时间3.5 h、pH 7.1，该条件下实现的双酶解工艺使得水解率高达46.16%。复合蛋白酶的初步酶解工艺优化将为后续探究风味蛋白酶二次酶解最优工艺奠定理论基础。◇

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Initially Production Technology of Protein Umami Peptide Compound Condiment

WANG Hong1，LIU Xin1，LI Jia-ni2，ZOU Xiao-shuang2，WANG Huan2，QI Bao-kun2，WANG Zhong-jiang2，JIANG Lian-zhou2

(1Heilongjiang GemChoice Food Co.，Ltd，Harbin 150060，China；2College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150060，China)

The protein flavor peptide produced by secondary hydrolysis technology could improve the protein yield effectively and be conducive to human absorption.The experiment according to the flavor characteristics of different water products，selected the sardine and shrimp as experimental material，the complex protease enzyme initially directional enzymolysis technology and ultrafiltration technology，preparation of peptide flavor improvement.The response surface method and the design of Box-Behnken to optimize the process of enzymatic hydrolysis of aquatic protein，the degree of hydrolysis was used as index to investigate the effects of enzyme addition，enzymatic hydrolysis temperature，time and pH on the yield of umami peptides.The optimal process conditions of enzyme preparation segmented umami peptides hydrolysis were compound protease hydrolysis enzyme amount 3.3%，temperature 57℃，hydrolysis time 3.5h，pH 7.1.

umami peptides；enzymatic hydrolysis；ultrafiltration

高品质系列复合调味品加工技术研究与应用(项目编号：2016DB3AS030)。

王 虹 (1980— )，女，本科，质量工程师，研究方向：调味品研究与开发。

江连洲 (1960— )，男，博士，教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

(责任编辑 唐建敏)