牦牛酸奶和酥油中乳酸菌的分离和鉴定

罗毅皓，孙万成

（青海大学农牧学院动物科学系,西宁 810016）

牦牛酸奶和酥油中乳酸菌的分离和鉴定

罗毅皓，孙万成

（青海大学农牧学院动物科学系,西宁 810016）

利用生化鉴定试剂盒，从青海不同地区牦牛酸奶样品以及酥油样品中分离出的乳酸菌种。分别为为嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、菌种为干酪乳杆菌干酪亚种或鼠李糖乳杆菌。采用MiSeq测序的方法测定微生物的组成结构及其分布，结果表明，大通样品中含有细菌种类5个，刚察样品中4个，共和样品中含有5个，玉树样品中含有4个。牦牛酸奶样品中主要优势菌为乳酸杆菌和链球菌，主要包括乳酸杆菌（Lactobacillus）和链球菌种（Streptococcus）。通过主成分分析得知大通与刚察的乳酸菌菌株遗传亲缘关系较近，玉树及共和的酸奶的乳酸菌菌株遗传亲缘关系最远。

牦牛酸奶，牦牛酥油，乳酸菌，鉴定

0 引言

牦牛乳与普通牛乳相比，含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、脂肪、乳糖和矿物质，因此具有极高的营养价值[1]。牧民沿用传统而古老的方法加工牦牛酸奶和牦牛酥油等乳制品，能较好地保存了当地自然环境中的有益微生物(特别是乳酸菌)[2]。通过分离出牦牛酸奶和酥油中的乳酸菌，对其菌种进行鉴定，分析其多样性，将为牦牛酸奶和酥油产品的商品开发提供基础研究[3-5]。

MiSeq测序的方法有效地避免了通量低、操作复杂和准确率低等缺陷[6-9]，它具有操作简单、成本较低的优势，并且采用边合成边测序原理，结果可信度高[10]。因此，利用MiSeq测序法可以更加快速、准确地分析牦牛酸奶中的乳酸菌多样性。

1 实验

1.1 材料

样本采集：样品分别采自青海大通，共和，刚察，玉树4个地区5个牧场牧民家庭自制传统发酵的牦牛酸奶样品和1个牦牛酥油样品。

材料：乳酸杆菌琼脂培养基、MRS肉汤、肉汤（LB Broth Medium），生化鉴定管。

仪器：PCR仪（ABI GeneAmp®9700型），Illumina HiSeq 2500高通量测序平台，QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统。

1.2 方法

1.2.1 菌种纯化

根据菌落形态特征挑选菌落，用乳酸杆菌琼脂培养基划线分离至纯菌株，将革兰氏染色阳性，显微镜下观察呈杆状的菌株初步选为乳酸杆菌。

1.2.2 生化鉴定

将分离出的菌种分别进行七叶苷，纤维二塘，麦芽糖，甘露醇，水杨苷，山梨醇，蔗糖，棉籽糖的发酵试管中，置37℃恒温箱中培养24 h。

1.3 MiSeq测序

1.3.1 基因组DNA抽提

完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

1.3.2 PCR扩增

每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

1.3.3 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用Quanti⁃FluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.3.4 Miseq文库构建

（1）连接“Y”字形接头；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

1.3.5 Miseq测序

（1）DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；（2）另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥 (bridge)”；（3）PCR 扩增，产生DNA簇；（4）DNA扩增子线性化成为单链。（5）加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；（6）用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；（7）将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端黏性，继续聚合第二个核苷酸；（8）统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

1.3.6 数据分析

对原始数据进行质量控制，舍弃低质量序列（质量值20以下的碱基）。用软件Flash连接通过质量控制的序列对应的两端序列进行。设计无法连接的序列。对连接上的序列进行过滤，获得最终用于分析的序列。对OTU列表中获得的分类信息与丰度进行整理，分别在科属种层次下对各样品进行Heatmap、群落结构组成,多样本相似度分析及PCA分析。

2 结果与讨论

2.1 生化鉴定

生化鉴定管在37℃下培养24 h以后结果如表1所示。

由表1可以看出，2个共和样品和玉树样品中的菌种为嗜酸乳杆菌，大通样品中的菌种为罗伊氏乳杆菌，刚察样品中的菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种，酥油中的样品菌种为干酪乳杆菌干酪亚种或鼠李糖乳杆菌。

2.2 MiSeq测序

大通，刚察，共和，玉树4个样品分别读取了16623,17641,21095,17984条有效序列。

2.2.1 样品所含操作分类单元及所含序列的数目

如图1所示，大通样品中含有乳酸菌种类5个，刚察样品中4个，共和样品中含有5个，玉树样品中含有4个。大通和刚察有相同种类4个，大通和刚共和有相同种类5个，大通和玉树有相同种类4个，刚察和共和有相同种类4个，大通和玉树有相同种类4个，共和和玉树有相同种类4个。大通刚察和共和有相同种类4个，大通、刚察和玉树有相同种类4个，大通、共和和玉树有相同种类4个，刚察、共和和玉树有相同种类4个，在相似度0.97基础上分类出5门，62702纲，3700目，196科，27属。

图1 操作分类单元文氏图

2.2.2 酸奶中群落组成分析

根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样本在各分类水平上的分类学比对情况[13]。如图2所示，样品所含物种基本相似，但物种分布差异较大，对所含主要种进行了分析和归类。主要物种包括2类，未分类乳酸杆菌种（Lactobacillus_unclassified）、唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus_salivarius_subsp._thermophilus）。样品中乳酸杆菌种含量最多，玉树样品与其他样品的不同在于玉树样品中唾液链球菌嗜热亚种较多，而其他3个地方牦牛乳样品都是乳酸杆菌种占绝大多数，有少量唾液链球菌嗜热亚种和极少量其他种菌类。

2.2.3 聚类分析

分别在科属种的水平上利用Heatmap图分析了菌群的相似性和多样性，牦牛酸奶菌落分为5个大的分支，其中最为优势的OTU单元为未分类的乳酸杆菌（Lactobacillus）；其中共和样品中未分类的乳酸杆菌（Lactobacillus_unclassified）包含序列数最多，含19 548条序列。由图3可知，在大通和刚察样品中未分类的乳酸杆菌（Lactobacillus_unclassified）包含序列也较多。

表1 发酵管生化鉴定

图2 酸奶样品物种分布图（种）

图3 系统发育进化树（种）

2.2.4 PCA分析

PCA分析[14](Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，利用各样品序列间的进化信息计算样品距离，观察4种不同酸奶样品多样性差异。由图4可知，PCA分析中大通与刚察的乳酸菌种遗传亲缘关系距离较近，玉树及共和的酸奶的乳酸菌遗传亲缘关系距离最远。表明酸奶样品群落存在一定的差异性，因此，地域分布差异对各个群落组成有很大影响。

2.2.5 多样本相似度树状图

图4 酸奶样品群落主坐标分析

利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。首先使用描述群落组成关系和结构的算法计算样本间的距离，即根据beta多样性距离矩阵进行层次聚（Hierarchical cluatering）分析[14]，使用非加权组平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。

利用各样品序列间的进化信息计算样品距离，观察4种不同酸奶样品多样性差异。由图可知，Hierar⁃chical cluatering分析中大通与刚察的乳酸菌距离较近，共和的酸奶的乳酸菌距离较远，玉树样品的乳酸菌距离最远。表明4个酸奶样品群落存在一定的差异性，因此，地域对各个群落组成有重要影响。

图5 相似度树状图

3 结论

（1）用乳酸杆菌琼脂培养基从青海各地区牧民酸奶中分离出乳酸菌，经过生化鉴定发酵管试验得出2个共和样品和玉树样品中的菌种为嗜酸乳杆菌，大通样品中的菌种为罗伊氏乳杆菌，刚察样品中的菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种，酥油中的样品菌种为干酪乳杆菌干酪亚种或鼠李糖乳杆菌。

（2）采用MiSeq测序的方法，直接从环境样品中扩增高变区进行测序，避免了不可培养菌株的不可测性，客观还原菌群结构及丰度比例，牦牛酸奶样品在相似度0.97基础上分类出细菌5门，62702纲，3700目，196科，27属。主要包括乳酸杆菌（Lactobacillus）和链球菌种（Streptococcus）。

（3）通过菌落组成分析，4个样品的主要优势菌为乳酸杆菌，所占比例均超过了50%，另外一种优势菌是链球菌。

（4）由PCA分析和Hierarchical cluatering分析可以看出4个样品菌群分布存在一定差异性，说明地域对其微生物组成影响较大。

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Separtarion and identification of Lactobacilli in yak yogurt and yak butter

LUO Yihao，SUN Wancheng
(Department of Animal Science,College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai 810016,China)

These were the research on the biological characteristics of Yak Yogurt samples and on of Yak butter sample from different areas in Qinghai.The results showed that three of six samples strain of Lactobacillus acidophilus,one the samples for Lactobacillus reuteri,one sample be⁃longs to Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and one sample can be Lactobacillus casei or Lactobacillus rhamnosus.Also,the microbial composi⁃tion structure and its distribution of the four samples can be measured by MiSeq sequencing method.The results showed that the samples from Datong,Gangcha,Gonghe and Yunshu contain five bacterial species,four species,five species and four species,respectively.The domi⁃nant bacteria from those samples is Lactobacillus and Streptococcus,which represents mainly including Lactobacillus and Streptococcus.Through prin⁃cipal component analysis,we found the Lactic acid bacteria from Datong sample and Gangcha sample was similar to each other while Yushu sample and Gonghe sample were quite different from other samples.

Yak yogurt；Yak butter；Lactobacillus；identification

Q93-331

A

1001-2230（2017）11-0011-03

2016-12-10

罗毅皓(1976-)，女，副教授，研究方向为食品生物技术。

孙万成