益气温阳护卫法防治支气管哮喘作用机制与防御素的相关性研究

余建玮 洪 燕 汤志利 喻强强 叶 超

1.江西中医药大学附属医院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西总队医院门诊部，江西南昌 330006

益气温阳护卫法防治支气管哮喘作用机制与防御素的相关性研究

余建玮1洪 燕2汤志利1喻强强1叶 超1

1.江西中医药大学附属医院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西总队医院门诊部，江西南昌 330006

目的研究与分析益气温阳护卫法防治支气管哮喘作用机制及与防御素的相关性。方法将240只SPF级雌性SD大鼠根据随机数字表法分为6组，A组（正常对照组）、B组（模型组）、C组（卡介菌多糖核酸组）、D组（益气温阳护卫低剂量组）、E组（益气温阳护卫中剂量组）和F组（益气温阳护卫高剂量组），每组各40只。分别于激发2周、4周、6周及8周各检测6组大鼠的肺组织α防御素及β防御素表达情况。结果激发2周、4周、6周及8周B～F组的肺组织α防御素及β防御素表达持续升高，且均高于A组，C～F组的表达均低于B组，D～F组的表达低于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论支气管哮喘大鼠的肺组织防御素表达增强，益气温阳护卫法对支气管哮喘大鼠的防御素表达控制较好，因此在支气管哮喘中的防治作用较好。

益气温阳护卫法；支气管哮喘；肺组织；防御素

近年来，世界各地支气管哮喘的发病率和死亡率一直较高，且呈现呈逐年增高的趋势[1]，因此临床对于支气管哮喘的重视程度极高。与支气管哮喘相关的研究显示，中药近年来的临床效果不断受到肯定，其中益气温阳护卫法的效果研究多见[2-3]，但是细致的防治机制及与防御素关系研究相对不足。本研究中我们就益气温阳护卫法防治支气管哮喘作用机制及与防御素的相关性进行探讨与分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将240只SPF级雌性SD大鼠根据随机数字表法分为6组，大鼠体重为200～220g。A组（正常对照组）、B组（模型组）、C组（卡介菌多糖核酸组）、D组（益气温阳护卫低剂量组）、E组（益气温阳护卫中剂量组）和F组（益气温阳护卫高剂量组），每组各40只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备 制备哮喘动物模型，其中B～F组均为哮喘动物模型组，模型各组大鼠分别于第1天腹腔注射新鲜配制的卵蛋白氢氧化铝溶液1mL(内含卵蛋白10mg及氢氧化铝200mg)致敏，并于第8天重复注射1次。自第15天起予以2%OVA雾化吸入激发哮喘，每天1次，每次30min，分别持续2周、4周、6周及8周。分别于激发2周、4周、6周及8周各处死10只大鼠，每次分别处死正常大鼠、模型组大鼠、地塞米松组大鼠和蠲哮片（江中药业股份有限公司，Z10960033）低、中、高组大鼠各5只，各组大鼠于末次雾化吸入后24h内用1%戊巴比妥钠（上海新亚药业有限公司，H31021724）1.0mL腹腔注射麻醉后，将其固定于手术台上，肺组织以液氮冻存，抽提总RNA和蛋白，用于Realtime PCR、Western blot检测。将肺组织采用SYBR Green Realtime PCR 技术检测靶基因检测α-防御素[人嗜中性白细胞肽(HNP)HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4和肠源性的潘氏细胞α-防御素(HD-5、HD-6)]及β-防御素 (HBD)[HBD-1、HBD-2、HBD-3和 HBD-4]等mRNA的表达。然后比较比较上述组别不同时间的检测结果。

表1 6组大鼠不同时间的α-防御素mRNA表达比较（± s）

表1 6组大鼠不同时间的α-防御素mRNA表达比较（± s）

注：与A组比较①P＜0.05；与B组比较②P＜0.05；与C组比较③P＜0.05

组别 HNP-1 HNP-2 HNP-3 HNP-4 HD-5 HD-6 A组 2周 0.38±0.02 0.43±0.04 0.11±0.02 0.35±0.02 0.56±0.05 0.45±0.04 4周 0.40±0.03 0.44±0.06 0.13±0.02 0.37±0.02 0.55±0.07 0.47±0.05 6周 0.37±0.02 0.42±0.05 0.12±0.03 0.38±0.03 0.53±0.06 0.44±0.06 8周 0.41±0.04 0.43±0.05 0.11±0.03 0.36±0.03 0.55±0.06 0.45±0.06 B组 2周 0.82±0.08① 0.92±0.10① 0.62±0.08① 0.71±0.06① 1.12±0.11① 0.95±0.12①4周 0.90±0.09① 1.02±0.11① 0.70±0.10① 0.84±0.07① 1.28±0.14① 1.07±0.13①6周 1.06±0.11① 1.15±0.13① 0.75±0.10① 1.01±0.09① 1.42±0.15① 1.15±0.15①8周 1.21±0.15① 1.35±0.16① 0.81±0.13① 1.18±0.013① 1.61±0.17① 1.21±0.20①C组 2周 0.70±0.06①② 0.78±0.05①② 0.46±0.05①② 0.62±0.05①② 0.84±0.08①② 0.71±0.08①②4周 0.81±0.07①② 0.88±0.07①② 0.50±0.06①② 0.73±0.05①② 0.92±0.10①② 0.82±0.10①②6周 0.90±0.09①② 0.96±0.08①② 0.53±0.06①② 0.83±0.07①② 1.02±0.11①② 0.90±0.11①②8周 0.98±0.11①② 1.06±0.12①② 0.60±0.07①② 0.90±0.10①② 1.13±0.13①② 0.99±0.13①②D组 2周 0.58±0.05①②③ 0.62±0.05①②③ 0.35±0.04①②③ 0.52±0.04①②③ 0.77±0.07①②③ 0.65±0.07①②③4周 0.65±0.06①②③ 0.70±0.06①②③ 0.37±0.05①②③ 0.56±0.05①②③ 0.84±0.08①②③ 0.73±0.08①②③6周 0.72±0.08①②③ 0.77±0.09①②③ 0.41±0.05①②③ 0.68±0.06①②③ 0.96±0.10①②③ 0.83±0.10①②③8周 0.81±0.08①②③ 0.86±0.10①②③ 0.44±0.06①②③ 0.72±0.08①②③ 1.04±0.11①②③ 0.92±0.12①②③E组 2周 0.52±0.04①②③ 0.55±0.05①②③ 0.29±0.03①②③ 0.45±0.04①②③ 0.72±0.06①②③ 0.60±0.06①②③4周 0.56±0.05①②③ 0.60±0.06①②③ 0.30±0.04①②③ 0.48±0.05①②③ 0.81±0.07①②③ 0.65±0.07①②③6周 0.63±0.06①②③ 0.68±0.07①②③ 0.32±0.04①②③ 0.55±0.06①②③ 0.93±0.10①②③ 0.73±0.08①②③8周 0.72±0.07①②③ 0.77±0.08①②③ 0.33±0.04①②③ 0.60±0.06①②③ 0.98±0.11①②③ 0.84±0.08①②③F组 2周 0.42±0.03①②③ 0.44±0.03①②③ 0.22±0.02①②③ 0.41±0.04①②③ 0.68±0.08①②③ 0.55±0.05①②③4周 0.43±0.03①②③ 0.50±0.05①②③ 0.23±0.02①②③ 0.44±0.06①②③ 0.78±0.10①②③ 0.59±0.07①②③6周 0.48±0.05①②③ 0.56±0.06①②③ 0.25±0.03①②③ 0.46±0.07①②③ 0.88±0.09①②③ 0.66±0.08①②③8周 0.62±0.05①②③ 0.66±0.07①②③ 0.26±0.04①②③ 0.52±0.08①②③ 0.92±0.09①②③ 0.76±0.07①②③

1.2.2 益气温阳护卫汤制备及应用 益气温阳护卫汤的制备：将生黄芪、白术、防风、桂枝、白芍、生姜、大枣、炙甘草、仙茅、仙灵脾等10味药按比例2：1.5：1.5：1：1：1：1：0.5：1：1.5配伍，其中白术、防风、桂枝、白芍、生姜提取挥发油。然后取8倍量冷水浸药半小时，第1煎1h（沸后）；第2煎加6倍量水煎40min，将两次煎液，过滤合并浓缩，将提取物混合成合剂，分别调至含生药2g/mL将各浓度溶液分别密封于无菌量瓶。将D组、E组及F组进行上述药物应用，分别按 0.36g/kg、0.72g/kg、1.44g/kg的剂量对大鼠进行益气温阳护卫汤药液灌服，于每天雾化吸入OVA前1h应用。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，计量资料以（）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠不同时间的α-防御素表达比较

激发2周、4周、6周及8周B～F组的肺组织α防御素表达持续升高，且B～E组均高于A组（F=6.689，7.125，7.884，6.521，5.893，8.015），C ～ F组的表达均低于B组（F=7.025，6.864，7.223，6.569，7.846，8.113），D～F组的表达低于C组（F=5.996，5.843，6.110，6.423，5.978，5.642），激发 8 周 F 组的HNP-1高于A组（t=7.963），激发6周及8周F组HNP-2及 HNP-4高于 A 组（F=8.125，7.560），激发2周、4周、6周及8周F组HNP-3、HD-5及HD-6均高于 A 组（F=7.586，6.651，7.203），差异有统计学意义（P＜0.05），D组、E组及F组的上述指标表达有所差异，但无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表2 6组大鼠不同时间的β-防御素表达比较（± s）

表2 6组大鼠不同时间的β-防御素表达比较（± s）

注：与A组比较①P＜0.05；与B组比较②P＜0.05；与C组比较③P＜0.05

组别 HBD-1 HBD-2 HBD-3 HBD-4 A组 2周 0.32±0.03 0.44±0.05 0.41±0.04 0.31±0.04 4周 0.33±0.02 0.42±0.06 0.43±0.05 0.33±0.04 6周 0.35±0.04 0.43±0.07 0.39±0.05 0.32±0.05 8周 0.33±0.03 0.44±0.06 0.40±0.04 0.30±0.05 B组 2周 0.81±0.08① 0.95±0.10① 0.85±0.08① 0.78±0.10①4周 0.95±0.10① 1.12±0.13① 0.99±0.10① 0.95±0.13①6周 1.02±0.12① 1.19±0.16① 1.11±0.12① 1.02±0.15①8周 1.12±0.13① 1.23±0.18① 1.18±0.15① 1.06±0.15①C组 2周 0.65±0.07①② 0.71±0.07①② 0.66±0.07①② 0.60±0.06①②4周 0.72±0.08①② 0.82±0.09①② 0.75±0.09①② 0.70±0.08①②6周 0.80±0.10①② 0.91±0.10①② 0.82±0.11①② 0.81±0.09①②8周 0.89±0.11①② 0.96±0.12①② 0.92±0.12①② 0.86±0.11①②D组 2周 0.51±0.05①②③ 0.58±0.06①②③ 0.52±0.05①②③ 0.43±0.05①②③4周 0.56±0.06①②③ 0.58±0.08①②③ 0.56±0.05①②③ 0.46±0.06①②③6周 0.60±0.08①②③ 0.63±0.09①②③ 0.61±0.07①②③ 0.52±0.08①②③8周 0.63±0.08①②③ 0.72±0.11①②③ 0.66±0.07①②③ 0.58±0.08①②③E组 2周 0.48±0.04①②③ 0.56±0.05①②③ 0.50±0.04①②③ 0.42±0.05①②③4周 0.51±0.05①②③ 0.52±0.05①②③ 0.51±0.05①②③ 0.43±0.05①②③6周 0.56±0.06①②③ 0.56±0.07①②③ 0.57±0.05①②③ 0.47±0.06①②③8周 0.59±0.07①②③ 0.63±0.08①②③ 0.59±0.06①②③ 0.53±0.07①②③F组 2周 0.45±0.03①②③ 0.46±0.04①②③ 0.46±0.05①②③ 0.35±0.04①②③4周 0.48±0.05①②③ 0.50±0.05①②③ 0.48±0.06①②③ 0.41±0.05①②③6周 0.50±0.06①②③ 0.53±0.06①②③ 0.52±0.06①②③ 0.46±0.05①②③8周 0.52±0.06①②③ 0.56±0.06①②③ 0.55±0.07①②③ 0.50±0.06①②③

2.2 6组大鼠不同时间的β-防御素表达比较

激发2周、4周、6周及8周B～F组的肺组织β防御素表达持续升高，且B～E组均高于A组（F=7.968，8.045，8.456，9.023），C ～ F 组的表达均低于 B 组（F=6.432，7.793，7.820，8.015），D ～ F组的表达低于 C 组（F=6.880，8.057，7.963，7.257），激发2周、4周、6周及8周F组HBD-1均高于A组（F=8.857），激发 6周及 8周 HBD-2、HBD-3及HBD-4 高于 A 组（F=7.663，6.541，6.823），差异有统计学意义（P＜0.05），D组、E组及F组的上述指标表达有所差异，但无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

支气管哮喘在临床多见，而与本病相关的治疗研究多见，且中医、西医的治疗效果多受肯定[4-5]。近年来，临床对于中医的研究占比不断升高，且研究多显示，中医治疗效果较好，中医主要为通过调节患者全身的综合机能状态为目标，通过治疗达到增强体质，防御疾病的能力，因此在减少哮喘的发作甚至达到长期缓解等方面成为治疗干预的重点[6-7]。益气温阳护卫法是根据哮喘反复发作的内因制定的治疗方案，其从患者“气阳虚弱、卫气不固”及“卫气根于下焦，滋养于中焦，宣发于上焦”等特点进行治疗方案的制定与实施，从调补肺、脾、肾三脏之气阳虚弱入手来达到调理机体的目的，从而实现提升呼吸道防御能力及免疫调节的作用。近年来临床可见益气温阳护卫法治疗支气管哮喘的疗效[8-9]，但是对于其对哮喘细致的影响研究不足。

防御素是临床中有效的抗菌杀菌物质，且在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中均有较强的作用，具有较高的稳态维持作用[10-11]，有研究认为在支气管哮喘中呈现显著异常的表达，在幼稚树突状细胞趋化及炎症聚集等方面均有反应意义，同时在肺损伤中具有反应价值[12-13]，因此其在支气管哮喘患者中的变化及药物对其影响的研究意义较高。

本研究就益气温阳护卫法防治支气管哮喘作用机制及与防御素的相关性进行观察分析，结果显示，支气管哮喘大鼠的肺组织α-防御素及β-防御素均呈现高表达状态，且随着激发时间的延长，其表达水平升高，均高于健康大鼠，同时益气温阳护卫法治疗大鼠的表达水平低于卡介菌多糖核酸干预大鼠，说明益气温阳护卫法在支气管哮喘大鼠中的调节治疗作用更好，而随着益气温阳护卫汤剂量的加大，其表达水平虽有下降，但是不显著，因此认为在药物应用剂量方面应进一步给予重视与研究。分析研究结果，我们认为益气温阳护卫法的应用使肺宣发肃降功能、脾之运化水湿功能、肾之蒸化水液功能均得到有效调节与改善，因此哮喘的控制作用得以凸显[14-15]，而益气温阳护卫法通过改善机体的阳气虚弱及卫气不固等方面来达到实现防控慢性肺系病发病的作用，而其在放空的过程中有效激发了机体的自我防御机制，其中肺组织α-防御素及β-防御素表达增强，因此肺部保护作用凸显，在降低炎性因素对呼吸系统的损伤的基础上，对其修复作用也有促进作用，因此应用效果突出。

综上所述，本研究认为支气管哮喘大鼠的肺组织防御素表达增强，益气温阳护卫法对支气管哮喘大鼠的防御素表达控制较好，因此在支气管哮喘中的防治作用较好。

[1] 张慧琪，朱振刚，李翀，等.吸入激素治疗哮喘对患者咽部黏膜分泌sIgA和防御素-2，3及血T细胞亚群的影响[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，30（18）：1470-1475.

[2] 孟颜，郭信长.白细胞介素-22、β-防御素-2与呼吸系统的免疫调节及哮喘关系的研究进展[J].国际免疫学杂志，2016，39（1）：97-100.

[3] 廖嘉仪，张涛.细菌溶解产物对支气管哮喘合并反复呼吸道感染患儿血清β防御素1及免疫球蛋白的影响[J].中国当代儿科杂志，2014，16（5）：508-512.

[4] 胡剑欢，喻强强，薛汉荣.益气温阳护卫法对哮喘患者T淋巴细胞免疫功能干预作用初探[J].中医药通报，2016，15（6）：36-38.

[5] 喻强强，张智玲，洪广祥，等.益气温阳护卫法对支气管哮喘缓解期(气阳虚弱证)患者防治作用的临床研究[J].中华中医药杂志，2017，32（6）：2790-2794.

[6] 崔殿波，王艳宏.过敏性哮喘的实验研究进展[J].哈尔滨医药，2014，34（4）：317-318.

[7] 周俊梅，韦芳，刘苗苗，等.针灸治疗支气管哮喘的实验研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2014，20（5）：4.

[8] 王俊壹，张卫华，刘舟.近三年中药治疗哮喘的实验研究进展 [J]. 光明中医，2015，30（12）：2536-2538.

[9] 邢亚群，王迪生，龙子江.附麻平喘方对哮喘模型大鼠的作用与机制的实验研究[J].世界中医药，2014，9（8）：1059-1062.

[10] 石蕾，庞剑.补肾益气平喘方对复合卵蛋白（OVA）哮喘大鼠血清IL-6及肺组织Bax、Bcl-2表达影响与地塞米松等效性随机平行对照研究[J].实用中医内科杂志，2017，31（6）：53-56.

[11] Alase A，Seltmann J，Werfel T，et al.Interleukin-33 modulates the expression of human β-defensin 2 in human primary keratinocytes and may influence the susceptibility to bacterial superinfection in acute atopic dermatitis[J].Br J Dermatol，2012，167（6）：1386-1389.

[12] 郭春荣，孙祝美，陈晨，等.宣肺平喘方对哮喘大鼠Rho/Rock信号通路调控作用的实验研究[J].中国中医药科技，2016，23（6）：656-659.

[13] 李昕辉.温阳抗寒合剂治疗支气管哮喘小鼠作用机制实验研究[J].北华大学学报：自然科学版，2016，17（1）：58-61.

[14] 卢雯雯，吴国琳，余国友.中药治疗支气管哮喘作用机制初探 [J].浙江中医杂志，2017，52（4）：299.

[15] 王宝凯，杨超，赵吉平.支气管哮喘从肺外脏腑论治的实验研究[J].临床误诊误治，2015，28（8）：100-104.

Study on the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin

YU Jianwei1HONG Yan2TANG Zhikli1YU Qiangqiang1YE Chao1
1.Lung Disease Department,the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangxi Provinical Corps Hospitial,Chinese People’s Armed Police Forces,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo study and analyze the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin.Methods240 female SD rats of grade SPF were divided into six groups,group A（normal control group）,group B（model group）,group C（BCG Polysaccharide and Nucleic Acid group）,group D（low dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,group E（middle dose of Yiqi Wenyang Huwei group）and group F（high dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,with 40 cases in each group according to the method of random number table.Then the expression situation of lung tissue α-defensins and β-defensins of six groups at second,forth,sixth and eighth week of provocation were detected.ResultsThe expression of lung tissue α-defensins and β-defensins of group B to group F at second,forth,sixth and eighth week of provocation were continuously increased,and they were all higher than those of group A,the expression of group C to group F were all lower than those of group B,the expression of group D to group F were lower than those of group C,there were all significant differences(P＜0.05).ConclusionThe lung tissue α-defensins expression of rats with bronchial asthma are intensive,so its prevention and treatment effect in the bronchial asthma is better.

Yiqi Wenyang Huwei method;Bronchial asthma;Lung tissue;Defensin

R259

A

2095-0616（2017）23-34-04

国家自然科学基金（81560767）；江西省自然科学基金（20132BAB215035）。

2017-10-30）