酶法提取葡萄酒渣多酚的含量与抗氧化性分析

李 浡，李双石，岳明星，陈 思，李兴娟

(北京电子科技职业学院，北京100176)

酶法提取葡萄酒渣多酚的含量与抗氧化性分析

李 浡，李双石，岳明星，陈 思，李兴娟

(北京电子科技职业学院，北京100176)

以酿酒葡萄皮渣为原料，研究提取物总酚含量及其体外抗氧化性。测定纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、木瓜蛋白酶以及复合酶提取葡萄皮渣中的总酚含量，分析提取多酚的抗氧化性。结果表明，葡萄梗的总酚含量相对比葡萄皮、籽的要高，最高达6.794 g/100 g。复合酶提取多酚效果较好，果胶酶提取效果次之。葡萄梗总酚含量较高，葡萄籽的抗氧化性效果较好。本研究可为葡萄酒渣多酚物质的开发利用提供参考。

葡萄酒渣； 酶； 抗氧化性； 总酚含量

多酚物质是羟基直接连接在苯环上的酚类及聚合物的总称。它们具有多种生理功能和药理作用，如具有抗氧化性、能清除体内自由基、抗衰老、降血脂、降血压、预防血管疾病、抗癌防癌、抑菌等作用[1]。葡萄多酚是一种植物多酚类活性物质，能溶于水，它广泛存在于葡萄籽、葡萄皮与葡萄梗中。葡萄多酚具有较强的自由基清除能力[2]，葡萄中的多酚对炎症、癌症和心血管疾病等都具有很好的防治作用[3]。葡萄酿酒仅仅选取经压榨的葡萄汁进行发酵，包含在葡萄梗、皮、籽中的很多有效成分并没有被完全利用，大量酒渣被视为垃圾处置[4]，这些垃圾既污染环境又造成资源浪费。

多酚物质的提取方法很多，包括酶法、溶剂浸提法、微波提取法、超声提取法等。考虑到超声、微波的方法在扩大生产规模时的局限性，酶处理方法在使用上更加简便，对设备和工艺的要求也相对较低[4]。酶反应条件温和，选择性强，近年来许多水解酶已被应用于葡萄酒渣中生物活性物质的提取研究中[5]。根据文献报道[4，6-9]，多采用纤维素酶、果胶酶、鞣酸酶和复合酶等提取葡萄皮、籽和梗的多酚物质。

本实验通过酶法提取酿酒葡萄皮、籽、梗的多酚物质，以DPPH自由基清除率以及FRAP法测定总抗氧化能力为指标考察酿酒葡萄皮、籽、梗的抗氧化活性，用不同酶解法的提取体系对其加以比较，并通过福林酚法（Folin-酚法）分别测定多酚物质的组成和含量，分析了抗氧化活性与多酚物质的组成和含量的关系，以评价葡萄酒渣的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品处理：将赤霞珠葡萄皮、籽、梗60℃烘干后，研碎，过60目筛即得供试原材料葡萄酒渣样品。

试剂及耗材：纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、木瓜酶、复合酶（纤维素酶和果胶酶混合比例为1∶2）,天津利华酶制剂厂；DPPH、TPTZ,美国Sigma公司；三氯化铁（FeCl3）、硫酸亚铁（FeSO4）、无水醋酸钠、没食子酸（分析纯），均为天津市华东试剂厂；无水乙醇、醋酸、盐酸均为分析纯，北京化工厂；水为超纯水。

仪器设备：AR2140分析天平,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机，北京医用离心机厂；UV-5800紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HHS11-Ni3B型电恒温热水浴锅，北京长安永创科学仪器有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 DPPH储备液

准确称取DPPH 0.00975 g，用无水乙醇定容到250 mL容量瓶中，超声后使其充分溶解得到浓度为100 μmol/L的DPPH储备液，置于冰箱中冷藏备用。

1.2.2 TPTZ工作液

TPTZ(10 mmol/L)溶液：称取312 mg的TPTZ溶于100 mL的40 mmol/L盐酸溶液中。

20 mmol/L的三氯化铁溶液：称取六水合三氯化铁0.54 g溶于100 mL水中。

pH3.6的醋酸缓冲液：称取无水醋酸钠10.2 g，加入40 mL醋酸，再用水定容到500 mL。

TPTZ工作液：将上述溶液按10∶1∶1比例配制即得到TPTZ工作液。

1.3 样品的制备

分别取葡萄皮、籽、梗∶酶=1000∶1（W/W），在60℃下酶解90 min，并在30℃中恒温水浴浸提0.5 h，5000 r/min离心10 min后收集上清液。

1.4 总酚含量的测定

葡萄皮、籽、梗样品的总酚含量采用福林-肖卡法[10]测定，取50 μL的提取液，加入2.5 mL稀释10倍的福林肖卡试剂和7.5 g/100 mL碳酸钠溶液2 mL，混匀，45℃条件下避光反应15 min后于765 nm波长处测定吸光度，每个处理重复3次，结果以没食子酸等价值表示(mg/100 g)。

1.5 抗氧化性测定

1.5.1 DPPH自由基消除能力测定

取0.5 mL按1.3方法制得的葡萄皮、籽、梗样品，加入2.5 mL含100 μmol/L DPPH的乙醇溶液，混匀，室温放置30 min后，5000 r/min离心5 min，在517 nm处测定吸光值（A样），以5000 r/min离心5 min过后的上清液调仪器零点；同时检测2.5 mL含100 μmol/L DPPH的乙醇溶液与0.5 mL蒸馏水的吸光值（A0）。对DPPH自由基的清除率（%）=[（A0-A样）/A0]×100%。

1.5.2 FRAP法测定抗氧化能力

配制不同质量浓度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL TPTZ工作液，37℃水浴30 min，测定595 nm处的吸光度。以蒸馏水为空白样调零。以吸光度为纵坐标，FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线。取1.0 mL按1.3方法制得的葡萄皮、籽、梗样品，以蒸馏水定容到10 mL，准确吸取稀释液50 μL，加入3.0 mL TPTZ工作液，37℃水浴30 min，测定595 nm处的吸光度。抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度来表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸标准溶液绘制标准曲线，其标准溶液浓度分别为 0、120 mg/L、240 mg/L、360 mg/L、480 mg/L、600 mg/L、720 mg/L，测定吸光度值，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为y=0.0012x+0.1016,R2=0.9910。

2.2 总酚含量的测定

根据步骤1.4中总酚含量的测定，分别对不同酶提取的葡萄皮、籽和梗中的总酚含量进行测定，结果见表1。

2.3 抗氧化性测定

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定

按照1.5.1中的操作步骤，测定A0和A样，测定不同酶提取的葡萄皮、籽、梗样品的多酚对DPPH自由基的清除率，实验结果为测定3次，取平均值，见表1。

2.3.2 FRAP法测抗氧化能力

按照1.5.2中的操作步骤，分别取1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、6.0 mmol/L、8.0 mmol/L、10.0 mmol/L不同质量浓度的FeSO4溶液，绘制标准曲线，见图1。标准曲线的回归方程为y=0.0876x+0.012，R2=0.9988。

图1 FeSO4溶液的标准曲线

测定不同酶提取的葡萄皮、籽、梗样品多酚在595 nm处的抗氧化能力，实验进行3次，取平均值，结果见表1。

由表1可以看出，总酚含量测定中，无论哪种酶提取的葡萄皮、籽和梗的多酚，葡萄梗的总酚含量相对比葡萄皮、籽的要高，最高达6.794 g/100 g。在几种酶提取的皮、籽和梗的多酚总量测定中，复合酶提取的总量较高，果胶酶其次。果胶酶适合提取葡萄皮、籽、梗中的有效物质，原因可能是葡萄皮渣中有果胶，果胶酶能够与其特殊部位进行特异性结合，比其他几种酶的水解度要高。

表1 总酚含量和抗氧化能力的测定

在对自由基清除率考察中，几种不同酶提取的葡萄皮、籽、梗样品，复合酶和果胶酶提取的多酚对自由基清除率较高，分别为93.58%、95.78%、94.30%。从不同酶提取皮、籽、梗的多酚对DPPH自由基清除率来看，葡萄籽多酚的平均自由基清除率最高，达到92.25%，其次为葡萄梗多酚的清除率达到了89.70%，葡萄皮多酚的平均清除率为89.16%。

在葡萄皮、籽、梗中使用几种不同的酶对其进行水解，结果表明，复合酶和β-葡聚糖酶提取多酚的抗氧化性相对较强。分别从不同酶提取皮、籽、梗的多酚抗氧化性来看，葡萄梗的抗氧化性最高，达到了5.411。

从以上结果得知，不同酶法提取的葡萄梗总酚含量较高，而抗氧化性也相应比较高。葡萄梗作为生产葡萄酒第一道工序中的废弃物，由于大量被丢弃，对环境造成一定的污染。能够开发和利用葡萄梗中的多酚物质，既能减少环境污染，又能充分利用资源[11]。葡萄皮、籽的总酚含量和抗氧化性并没有对应性，总酚含量和抗氧化性的对应规律并不明显，部分原因由于总酚中的一些酚类不具有抗氧化活性。

3 结论

本实验测定了不同酶提取葡萄皮、籽、梗的总酚含量，果胶酶的提取效果相对较好。葡萄梗总酚含量较高，抗氧化性效果较好。为葡萄梗的开发和利用提供了参考依据。

[1]牛春艳,姜晓坤.葡萄皮渣中多酚物质提取工艺的研究[J].辽宁化工,2011,40(9)：917-919.

[2]UGARTONDO V,MITJANS M,TOURINO S,et al.Comparative antioxidant and cytotoxic effect of procyanidin fractions from grape and pine[J].Chemical research in toxicology,2007,20(10)：1543-1548.

[3]ENGELBRECHTA M,MATTHEYSE M,ELLIS B,et al.Proanthocyanidin from grape seeds inactivates the PI3-kinase/PKB pathway and induces apoptosis in a colon cancer cell line[J].Cancer letters,2007,258(1)：144-153.

[4]杨云裳,李帅斌,李春雷,等.酶法浸提酿酒葡萄果渣中多酚的最优工艺[J].兰州理工大学学报,2013,39(3)：61-64.

[5]李双石,李浡,马越,等.葡萄梗(茎)中的生物活性物质研究现状[J].食品工业科技,2014(7)：348-351.

[6]彭丽霞,黄彦芳,刘翠平,等.酿酒葡萄皮渣的综合利用[J].酿酒科技,2010(10)：93-96.

[7]李婷,李胜,张青松,等.酶法提取葡萄皮渣中白藜芦醇工艺研究[J].食品科学,2008,29(12)：194-197.

[8]钱时权,石亚中,伍亚华,等.纤维素酶对山葡萄渣中白藜芦醇提取的影响[J].食品与发酵工业,2011,37(3)：207-209.

[9]张贵娟,杨涛,罗非君,等.白藜芦醇的提取与检测方法研究进展[J].食品与机械,2013,29(2)：234-237.

[10]JAVANMARDI J,STUSHNOFF C,LOCKE E J,et al.Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian Ocimum accessions[J].Food chemistry,2003,83(4)：547-550.

[11]李浡,李双石,兰蓉,等.葡萄梗多酚物质的提取和成分分析[J].食品研究与开发,2015,36(4)：50-53.

Total Polyphenol Content and Antioxidant Activities of the Extract from Grape Skin Residues by Enzyme Method

LI Bo,LI Shuangshi,YUE Mingxing,CHEN Si and LI Xingjuan
(Beijing Polytechnic,Beijing 100176,China)

The total polyphenol content and the antioxidant activities of the extract from grape skin residues were investigated.The grape skin residues were extracted by cellulose,β-glucanase,pectinase,papain and compound enzyme respectively.The results suggested that,total polyphenol content of grape stems were about 6.794 g/100 g,higher than that of grape skin and grape seed.Compound enzyme had the best extraction effects,followed by pectinase.Besides,the antioxidant activities of grape seed were the best.This study provided useful reference for the utilization of polyphenols in grape skin residues.

grape skin residue;enzyme;antioxidant activity;total polyphenol content

TS262.6；TS261.4；TS261.9

A

1001-9286（2017）12-0037-04

10.13746/j.njkj.2017244

北京市属高等学校人才强教计划资助项目（PXM2016-014306-000005）；北京电子科技职业学院院内重点课题（2017Z005-005-KXB）。

2017-09-11

李浡（1973-），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。

李双石。

优先数字出版时间：2017-10-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171027.1103.007.html。

“续写传奇·再出发”董酒六十周年庆典在遵义举行

本刊讯：2017年11月18日上午，“续写传奇·再出发”董酒六十周年庆典活动在遵义市董公寺董酒厂隆重举行。遵义市市政府有关部门领导、行业专家、学者、新闻媒体，以及董酒厂全体员工共计600余人参加了此次庆典活动。活动仪式由中国酒类流通协会秘书长秦书尧主持。

上午9:00时活动开始，董酒股份有限公司总裁刘智涛为60周年庆典致欢迎辞，并向与会来宾介绍了董酒厂的相关发展历史。董酒股份有限公司董事长蔡友平在庆典上发表重要讲话，并公布了董酒未来40年的长远发展目标规划。在蔡董事长发言中的目标规划中，董酒将在2018年—2057年内按照3个阶段逐步发展，从打造名优品牌、产业链整合优化、成立科技学院、资本化运作等方面助力董酒的发展。

遵义市委市政府相关领导在庆典上讲话中指出，遵义市接下来将成立白酒产业基金支持董酒在内的遵义白酒企业发展，实现白酒集散遵义，流通世界的目标，通过抓龙头，建集群、强配套、铸链条等措施，形成真正的集研发、生产、营销、集散贸易为一体的集团产业链，以应对白酒行业的发展周期。

庆典上，还举行了由董酒厂代表向当地小学赠送5000册图书的捐赠仪式，在场领导及嘉宾一起启动了“董酒续写传奇再出发”仪式，并举行了封坛仪式。庆典活动还举行了全体董酒员工集体宣誓仪式，作为董酒的员工，每一个董酒人都会恪守真诚，认真酿好每一杯酒，为每一个喝董酒、喜爱董酒的朋友提供最好的佳酿！庆典结束后，董酒公司董事长蔡友平陪同与会领导及嘉宾参观了董酒厂厂区，深入车间了解董酒的发展历史及生产工艺。

下午14:00时，董酒公司在遵义桂花山大酒店举行了“中国传统白酒文化价值论坛暨董酒60周年纪念酒首发仪式”，与会嘉宾各抒己见，对中国传统白酒的历史及文化进行了讨论。

蔡董事长表示，藉此60周年庆典契机，董酒将进入一个全新的发展阶段，将从设施、技术的升级，人才的培养、配套设置的建设、全国销售布局等角度，科学规划今后四十年的发展目标和实现路径，实现跨越式的发展，未来将形成以白酒板块和健康产业为主的两大支柱产业，力争实现两大产业历史突破。董酒将不断强化品牌传播和与消费者的互动，扩大消费群体对董酒的认可和青睐，通过不断扩大基础消费群体来带动董酒规模的大幅度提升；将不断强化与上下游伙伴的合作，通过优势互补，共同发展，合作共赢的生态合作模式，与合作伙伴共同成长，分享红利。（晓文、萤子、小雨）