星点设计-响应面法优化桑葚果酒发酵工艺

杨 芳，王中兴，王克刚，田 野，崔高超，魏腾飞

(1.安康学院现代农学与生物科技学院，陕西安康725000； 2.陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康725000；3.安康学院电子与信息工程学院，陕西安康725000)

星点设计-响应面法优化桑葚果酒发酵工艺

杨 芳1，王中兴1，王克刚3，田 野2，崔高超1，魏腾飞1

(1.安康学院现代农学与生物科技学院，陕西安康725000； 2.陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康725000；3.安康学院电子与信息工程学院，陕西安康725000)

通过星点设计-响应面法优化桑葚果酒发酵工艺。选择发酵温度、蔗糖添加量、接种量为自变量，桑葚果酒总残糖、总酸、总黄酮、乙醇、感官综合评分作为因变量，对自变量各因素水平进行多元线性回归和多项式拟合。经design expert 7软件处理后得到的最佳发酵工艺参数为：发酵温度为15.3℃，接种量为8.00 g/L，蔗糖加入量为12.80 g/100 g。桑葚果酒预测值分别为：总残糖3.18 g/L、总酸6.82 g/L、总黄酮410.49 mg/L、乙醇14.12%vol、感官综合评分81.91。在此条件下进行验证试验，发酵桑葚果酒共3份，各项指标实测值分别为：总残糖3.27 g/L、总酸6.61 g/L、总黄酮405.21 mg/L、乙醇14.21%vol、感官综合评分82.33。实测值与模型预测值间的偏离率分别为-2.8%、3.1%、1.3%、-0.6%、-0.5%。根据优化发酵工艺参数，平行制备3份样品，所得桑葚果酒各指标实测值与理论预测值接近，表明建立的回归方程预测性良好。

桑葚； 果酒； 发酵工艺； 优化； 星点设计-响应面法

药食同源的桑葚因其果肉多汁，色泽艳丽，香气幽雅，色素含量高且稳定，是酿酒的极佳原料[1]。桑葚中黄酮类化合物具有增强毛细血管强度、抗自由基、抗病毒、抗炎、调节血脂等生物学活性[2-8]。文献报道桑葚水解物（含槲皮素-3-O-芸香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-芸香苷）具有抑制膳食丙烯酰胺诱导的活性氧过度产生，恢复细胞线粒体膜电位，抑制线粒体膜脂质过氧化和谷胱甘肽毒，增加冠动脉流量，抑制脑组织脂质过氧化等作用。桑葚中有机酸以柠檬酸为主[10]。

有机酸同时也是决定果酒口感的重要风味物质。果酒中有机酸含量的高低与果酒的品质有着密切的关系[11]。前期的实验表明，桑葚果酒中有机酸含量过高，容易造成酒味酸涩，酒体粗糙，难以入口，直接影响桑葚果酒的感官综合评分。桑葚果酒发酵是将桑葚中葡萄糖、果糖、纤维素等多糖进行酵解的过程。桑葚果酒残存的总残糖含量间接反映了酵解的程度。

星点设计响应面优化法是一种新型的实验设计方法。较均匀设计和正交实验设计，星点设计响应面优化法能更灵敏地考察各因素间的交互作用，实验精确度更高，近些年逐渐被用于食品科学实验的设计[12-13]。本研究主要是通过星点设计响应面优化法来对桑葚果酒发酵条件进行设计，选择发酵温度、蔗糖添加量、接种量为自变量，桑葚果酒总残糖、总酸、总黄酮、乙醇、感官综合评分作为因变量，对自变量各因素水平进行多元线性回归和多项式拟合，通过数学模型进行预测最佳桑葚果酒发酵工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：“大十”新鲜桑葚，产自陕西省安康市汉滨区张滩镇。接种酵母菌为安琪活性干酵母。

试剂及耗材：30～60目聚酰胺、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化铵、无水葡萄糖标准品、石油醚、无水硫酸钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、乙醇、乙酸均为分析纯，甲醇、槲皮素标准品、乙醇标准品均为色谱纯。

仪器设备：上海光谱SP-723分光光度计、Agilent 7890A气相色谱仪、四川优普UPT-II超纯水机、赛多利斯ALC-210.4微量分析天平、Thermo Legend Micro17R微量冷冻高速离心机、上海雷磁PHS-3C pH计、0.22 μm滤膜、Agilent DB-5气相毛细管色谱柱。

1.2 实验方法

1.2.1 检测指标的测定方法

1.2.1.1 桑葚酿造果酒总残糖含量的测定——3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）[14]

1.2.1.2 桑葚酿造果酒总酸含量的测定

用邻苯二甲酸氢钾作基准物质标定NaOH溶液。桑葚果酒以12000 r/min离心10 min后，移取上清液2 mL至离心管。用氢氧化钠标准溶液进行滴定，利用pH计来调节终点电位与预控电位。滴定终点电位是8.3[15]。记录此时消耗的氢氧化钠的体积。按下列公式计算桑葚果酒总酸含量：

总酸含量（g/L）=C×Vk×V1/V2。

其中：C为氢氧化钠标准溶液浓度g/mL，Vk为柠檬酸系数[10]，V1为氢氧化钠标准溶液消耗体积（mL），V2为桑葚果酒上清液取样体积（L）。

1.2.1.3 桑葚酿造果酒总黄酮——聚酰胺吸附-硝酸铝显色法[16]

1.2.1.4 桑葚酿造果酒乙醇含量测定——气相色谱法[18]

GC条件：DB-5气相毛细管色谱柱（30m×320μm，0.25 μm）；进样口温度220℃；分流进样，分流比为20∶1；程序升温，40℃保持4 min，然后以3.5℃/min升至50℃，再以25℃/min升至200℃；检测器FID，检测器温度220℃，氢气流量30 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量11.5 mL/min；恒流模式，流速0.5 mL/min。

制作标准曲线：精密量取乙醇标准品稀释，使浓 度 分 别 成 为 0.02%vol、0.05%vol、0.1%vol、0.2%vol、0.3%vol的系列对照品溶液，进样量为1 μL，测定峰面积，按内标法以峰面积计算。

每个果酒样品取200 μL，用纯水稀释至10 mL后过滤上样，进样量1 μL。故计算时的稀释体积为50倍，每个样品处理2次分别进单针得到结果。

1.2.2 响应面设计

在前期预试验基础上，采用响应面法（RSM）对影响桑葚果酒酿造的主要因素以发酵温度（A，℃）、接种量（B，g/L）、蔗糖加入量（C，g/100 g）3个因素为响应因子进行优化。每个因素设计5个水平，分别用代码-α、-1、0、1、α（在本实验中α=1.682）表示，设计因素与水平见表1。以桑葚果酒总残糖、总酸、总黄酮、乙醇、感官综合评分为响应值进行试验安排。

表1 设计因素与水平

1.2.3 桑葚酿造果酒感官综合评价

发酵型桑葚果酒制备完成，从果酒的色泽、香气、滋味、风格4个方面对桑葚果酒进行评分，桑葚酿造果酒感官综合评价参照文献[13]进行。

表2 星点设计试验结果

2 结果与分析

2.1 乙醇的测定线性关系考察

精密量取乙醇稀释，使浓度分别为0.02%vol、0.05%vol、0.1%vol、0.2%vol、0.3%vol的系列对照品溶液，进样，测定。以乙醇体积百分比（X）对峰面积积分值（Y）进行线性回归，得回归方程y=2669.8192770x+1.4042169，R2=0.9999781。乙醇标准品气相色谱图见图1。

2.2 星点设计试验结果及响应面分析

依据星点设计-响应面法试验方案进行3因素5水平试验，星点设计试验安排与桑葚果酒总残糖、总酸、总黄酮、乙醇、感官综合评分5个响应值结果见表2。桑葚果酒样品气相色谱图见图2。

2.3 模型拟合及工艺优化

以桑葚果酒总残糖、总酸、总黄酮、乙醇、感官综合评分分别为因变量，使用Design-Expert软件采用二次多项式非线性模型对各影响因素和指标进行回归计算，其方程如下：

图1 乙醇标准品色谱图

2.4 响应曲面图与等高值线图

采用design expert 7软件绘制二次多项式模型中A，B，C中任意2因素对各评价指标的三维效应曲面图（其余自变量设为中心点值），见图3—图7。通过响应面三维图，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，有助于确定最佳酿造工艺参数范围。

图2 桑葚果酒色谱图

图3 发酵温度和蔗糖加入量对桑葚果酒总残糖影响的三维曲面图和等高线图

图4 发酵温度和蔗糖加入量对桑葚果酒总酸影响的三维曲面图和等高线图

2.5 验证试验

经design expert 7软件处理后得到的最佳条件为：发酵温度为15.3℃，接种量为8.00 g/L，蔗糖加入量为12.80 g/100 g。在此条件下进行验证试验，发酵桑葚果酒共3份，按照“1.2”各项方法进行试验，模型预测值、桑葚酿造果酒检测各项指标实测值、与模型预测值间的偏离率见表3。

图5 发酵温度和接种量对桑葚果酒总黄酮影响的三维曲面图和等高线图

图6 发酵温度和接种量对桑葚果酒乙醇含量影响的三维曲面图和等高线图

图7 发酵温度和接种量对桑葚果酒感官综合评分影响的三维曲面图和等高线图

表3 优化发酵工艺验证

3 讨论

黄正勇[19]的研究指出桑葚果酒发酵过程质量控制的3个要素分别为蔗糖添加量、酵母菌的选择及接种量、发酵温度及时间控制。桑葚果酒乙醇产生的影响因素依次为发酵温度＞接种量＞蔗糖添加量[20]。分析不同发酵工艺条件下，将桑葚果酒中总残糖、总酸、总黄酮、乙醇4个因子与桑葚果酒的相关性，分析结果表明，乙醇(0.72266)与感官综合评分呈正相关，总酸(-0.59133)与感官综合评分呈负相关，是影响果酒感官综合评分的两个重要因素。将桑葚果酒发酵工艺条件中发酵温度、接种量、蔗糖添加量3个因子与桑葚果酒中乙醇、总酸的相关性，接种量(0.41813)、蔗糖添加量(0.57499)作为正向影响因素；发酵温度(-0.04528)作为负向影响因素，影响程度轻。接种量（-0.57338）与总酸的负向相关性较高。发酵温度在一定范围内偏低，酵母菌的代谢活动相对较弱，发酵变得缓慢，发酵周期延长，对醇类物质的积累有负向作用。接种量的大小也直接影响发酵周期，直接决定生产菌种在发酵过程中生长繁殖的速度和乙醇的产生速度。在本次试验中，当接种量为0时，发酵完全依赖桑葚所含的天然酵母菌发酵，发酵温度偏低，在短期内无法形成优势菌，感染杂菌的机率增大，24 d总发酵时间相对该条件偏长，导致桑葚果酒在24 d时总酸高出其他组。高浓度的初糖由于阻遏了乙醇脱氢酶产生，对果酒发酵有抑制作用。同时，高浓度糖导致高渗透压、低水分均不利于酵母菌的生长[20]。蔗糖添加量作为乙醇产生的正向影响因素应该在一定的范围内发挥作用。

根据优化发酵工艺参数，平行制备3份样品，所得发酵型桑葚果酒各指标实测值与理论预测值接近，表明建立的回归方程预测性良好。在生产过程中，发酵温度可设为15℃。

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Optimization of the Fermentation Process of Mulberry Wine by Central Composite Design-Response Surface Method

YANG Fang1,WANG Zhongxing1,WANG Kegang3,TIAN Ye2,CUI Gaochao1and WEI Tengfei1
(1.School of Modern Agriculture and Biotechnology,Ankang University,Ankang,Shaanxi 725000;2.Key Lab of Sericulture,Ankang,Shaanxi 725000;3.College of Electronic and Information Engineering,Ankang University,Ankang,Shaanxi 725000,China)

To optimize the fermentation process of mulberry wine,fermenting temperature,cane sugar adding level,and inoculating quantity were used as dependent variables,and residual sugar content,total acids,total flavonoids,ethanol content,and sensory comprehensive score were used as independent variables.On the basis of single-factor experiments,3-factor and 5-level central composite design was adopted,then validation test was conducted.The optimal fermentation parameters were summed up as follows through design expert 7 processing:fermenting temperature was at 15.3℃,inoculating quantity was 8.00 g/L,and cane sugar adding level was 12.80 g/100 g.The predicted values of mulberry wine were as follows:total residual sugar content was 3.18 g/L,total acids content was 6.82 g/L,total flavonoids content was 410.49 mg/L,ethanol content was 14.12%vol,and comprehensive sensory score was 81.91.The validation test demonstrated that,total residual sugar content was 3.27 g/L,total acids content was 6.61 g/L,total flavonoids content was 405.21 mg/L,ethanol content was 14.21%vol,and comprehensive sensory score was 82.33.The bias ratio of predicted values and real values were-2.8%,3.1%,1.3%,-0.6%,and-0.5%respectively.On the basis of the optimized fermentation parameters,3 wine samples were prepared and their predicted values and real values were very close,which proved the good predictability of the established regression equation.

mulberry;fruit wine;fermentation technology;optimization;central composite design-response surface method

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）12-0021-06

10.13746/j.njkj.2017258

陕西省教育厅科技专项（15JS003），安康市科技专项（2016AKZDCY001）。

2017-09-19

杨芳（1974-），女，陕西旬阳人，讲师，硕士，主要从事食品功能评价研究，E-mail：akxyyf@163.com。

优先数字出版时间：2017-11-01；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171101.1314.007.html。