LncRNA MEG3在甲状腺乳头状癌中的表达及对增殖、侵袭与转移能力的影响

崔大炜++++++姜峰++++++陈大欣

[摘要] 目的 探讨lncRNA MEG3在甲状腺乳头状癌中的表达意义以及对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭转移能力能力的影响。 方法 收集2012年5月～2015年12月于遵义医学院第五附属珠海医院手术切除的甲状腺乳头状癌标本以及对应的癌旁组织，采用real-time PCR技术分别检测68例甲状腺乳頭癌组织中MEG3表达情况，并分析其表达情况与临床病理参数的关系；通过细胞转染技术构建MEG3高表达甲状腺癌TPC-1细胞系，利用CCK-8方法检测MEG3对甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的影响；采用Transwell方法检测MEG3对甲状腺乳头状癌细胞侵袭迁移与转移能力的影响；利用Western blot方法检测过表达MEG3基因后对甲状腺乳头状癌细胞Snail2蛋白表达的影响。 结果 lncRNA MEG3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05）；MEG3在甲状癌组织中的表达与肿瘤大小、TNM分期有关（P < 0.05），与其他病理参数无关（P > 0.05）；TPC-1细胞系中过表达MEG3可使甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力降低，并且能够抑制甲状腺乳头状癌细胞的侵袭与转移能力（P < 0.05）。real-time PCR和Western blot检测发现，过表达MEG3能够显著抑制Snail2基因与蛋白的表达（P < 0.05）。 结论 lncRNA MEG3在甲状腺乳头状癌中表达显著降低且与甲状腺的发生发展相关。MEG3能够显著抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力，且能够通过抑制Snail2蛋白的表达抑制状腺癌细胞的侵袭与转移能力。

[关键词] MEG3；甲状腺乳头状癌；长链非编码RNA

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（b）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of lncRNA MEG3 in papillary thyroid carcinoma and explore the effect of MEG3 on proliferation， migration and invasion in PTC-1 cells. Methods 68 cases of papillary thyroid carcinoma specimens and paired normal tissue were collected after surgery from May 2012 to December 2015 in the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College. The expression of MEG3 was analyzed by quantitative real-time PCR. The effect of MEG3 on proliferation in TPC-1 cells was detected by CCK-8 method. The effect of MEG3 on migration and invasion abilities of TPC-1 cells were analyzed by Transwell assays. The expression of Snail2 was detected by Western blot. Results The expression of MEG3 was lower in papillary thyroid carcinoma tissues than adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression of MEG3 was related with TNM stage and tumor size （P < 0.05）. Over expressed MEG3 significantly inhibited the proliferation of TPC-1 cells （P < 0.05）. And MEG3 could decrease the abilities of migration and invasion by down regulating the expression of Snail2 （P < 0.05）. Conclusion The expression of lncRNA MEG3 is lower in the papillary thyroid carcinoma and can inhibit the proliferation， migration and invasion of TPC-1 cells can be inhibited by the expression of Snail2.

[Key words] MEG3； Papillary thyroid carcinoma； lncRNA

甲状腺癌（Thyroid cancer，TC）是常见的内分泌恶性肿瘤之一，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其中最常见的病理类型。其发病率呈逐年上升的趋势且在头颈部肿瘤中占主要地位[1-2]。近几年研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤的发生发展过程中起到了重要的调控作用[3]。越来越多的研究证实，许多lncRNA在甲状腺癌中具有差异性表达且能够影响甲状腺癌的恶性生物学行为[4-6]。其中，lncRNA母系印记基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）作为通过表观遗传学受到表达调控的抑癌基因[7]，引起了人们广泛的关注与研究，而MEG3在甲状腺乳头状癌中的表达情况和意义尚不十分清楚。本研究拟通过检测MEG3在甲状腺乳头状癌组织中表达情况，探讨MEG3对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭与转移能力的影响。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

68例甲状腺乳头状瘤标本及相对应的癌旁组织为2012年1月～2015年12月于遵义医学院第五附属珠海医院行手术切除。所有标本手术切除后立即放置于液氮中并存储于-80℃冰箱以备实验使用。病理诊断由术后病理切片检测为标准。所有患者术前均未进行碘131等治疗。其中男性29例，女39例；年龄36～69岁，平均（44.7±5.4）岁，其中<45岁38例，≥45岁30例；肿瘤直径<2 cm者44例，≥2 cm者24例；肿瘤病灶单发38例，多发30例；低分化28例，中、高分化56例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移47例。本研究通过医院医学伦理审查，所有标本检测均经患者及其家属同意，并签署知情同意书。

1.2 real-time PCR

所有甲状腺乳头状癌及癌旁组织剪碎后，用Trizol试剂（invitrogen，San Diego，USA）提取组织总RNA，根据试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR反应（real-time PCR）体系按照SYBR Green说明书配制。real-time PCR反应条件：95℃持续3 min；95℃变性5 s，退火60℃ 30 s，共40个循环。以MEG3基因与内参GADPH相对浓度的比值来表示MEG3基因的表达量，相对表达量计算方式采用2-△△Ct法。MEG3基因的上游引物序列：5′-GCCAAGCTTC？鄄TTGAAAGGCC-3′，下游引物序列：5′-TTCCACGGAG？鄄TAGAGCGAGTC-3′；Snail2上游引物序列：5′-GAGGCGGTGGCAGACTAG-3′，下游引物序列：5′-GACACATCGGTCAGACCAG-3′；GADPH的上游引物序列：5′-CATGGAATCCTGTGGCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGATCTTCATGGTGCTGGG？鄄A-3′。

1.3 Western blot检测

将转染MEG3质粒48 h的TPC-1细胞，利用RIPA裂解液将细胞裂解，蛋白样本利用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜并用封闭液封闭2 h或4℃封闭过夜；转膜后孵育Snail 2（Abcam，USA）、β-actin抗体（Proteintech，USA）后4 ℃温育过夜。用TBST洗3次，每次10 min；加入ECL化学发光试剂（Pierce，USA）A、B各1 mL，混匀，浸透PVDF膜；暗室中进行显影。定量方法可利用Image J进行灰度值分析并与内参β-actin进行比值。

1.4 细胞培养与转染

甲状腺癌TPC-1细胞系购于中科院细胞库，利用含15%胎牛血清的DMEM培养基培养。MEG3过表达质粒pcDNA3.1-MEG3购于基凯基因公司（上海），空载质粒pcDNA3.1-NC为阴性对照。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）根据说明书进行转染。转染效率利用qRT-PCR检测。

1.5 细胞增殖实验

细胞增殖利用CCK-8方法进行验证。在96孔板中加入转染pcDNA3.1-MEG3的TPC-1细胞系，100 μL/每孔（约3×103细胞）。对照组加入转染pcDNA3.1-Nc的TPC-1细胞。分别在0、24、48、72 h进行细胞增殖检测。每孔加入10 μL的CCK-8溶液在37℃培养3 h。在450 nm进行吸光度检测细胞数量。

1.6 侵袭和迁移实验

将转染pcDNA-MEG3质粒和空载质粒的TPC-1细胞调整细胞浓度于5×105个/mL细胞悬液，分别置于24孔、8 μL的Transwell小室上层，侵袭实验中在上层底部覆盖Matrigel生物胶。并在上室中加入100 μL不含胎牛血清的RPMI1640培养液，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液，每组3个复孔。37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48 h后，将小室取出，用无水酒精固定15 min，结晶紫固定20 min，将小室倒置于相差倒置显微镜下观察穿过半透膜附着于小室下层的细胞，任意选取5个视野，计数每高倍视野平均细胞数并同时照相。

1.7 統计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA MEG3在甲状腺乳头状癌中的表达情况

real-time PCR检测结果显示，MEG3在甲状腺乳头状癌中的相对表达值为0.36±0.08，癌旁组织中的相对表达值为0.85±0.17，MEG3在癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 甲状腺乳头状癌中MEG3的表达与患者临床病理特征之间的关系

为了进一步了解MEG3对于甲状腺癌发生发展的影响，本研究分析甲状腺乳头状癌组织中MEG3的表达与临床病理参数之间的关系。以MEG3表达的中位值为临界值，将68例甲状腺癌病例分为MEG3高表达组（34例）和MEG3低表达组（34例）。结果提示：甲状腺乳头癌中MEG3表达与TNM分期和肿瘤大小显著相关（P < 0.05），而与患者性别、年龄、病灶数、淋巴结转移无关（P > 0.05）。见表1。

2.3 MEG3对甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的影响

为了探索MEG3对于甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的影响，本研究通过CCK-8方法检测增殖曲线的变化。首先，通过细胞转染技术构建过表达MEG3的TPC-1细胞系，其转染后比空载对照组MEG3表达上升（P < 0.05）。然后，利用CCK-8方法分别在0、24、48、72 h检测细胞含量，分析结果表明MEG3过表达后能够显著抑制TPC-1细胞的增殖能力（P < 0.05）。见图2。endprint

2.4 MEG3對甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移能力的影响

为了探求MEG3对于甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移能力的影响，通过细胞转染技术构建过表达MEG3的TPC-1细胞系，以空载质粒为对照组，利用Transwell小室培养48 h，结晶紫染色，显微镜下放大200倍进行观察。结果显示，MEG3能够显著抑制甲状腺乳头状癌细胞TPC-1侵袭与转移能力（P < 0.05）。见图3。

2.5 MEG3对甲状腺乳头状癌细胞Snail2表达的影响

诸多研究表明，Snail2在肿瘤细胞侵袭转移能力中起到了重要的作用。因此，本研究通过PCR、Western blot实验探求MEG3基因对于甲状腺乳头状癌细胞Snail2的表达是否起到了调控作用。如图4所示，当过表达MEG3基因后TPC-1细胞中Snail2蛋白与mRNA的表达显著降低（P < 0.05）。

3 讨论

哺乳动物基因组中超过90%的基因均无编码功能，在过去人们一直认为这些基因是无功能的。而随着人类基因计划的完成，一直认为是“转录噪声”的非编码RNA被证实在细胞的生命活动中发挥着重要的调控功能[8]。其中根据长度分类，人们将长度大于200个碱基的非编码RNA称为lncRNA[9]。不断有研究证实，许多lncRNA在甲状腺中存在差异性表达，并且能够对甲状腺癌的发生发展产生影响[4，10-11]。Li等[12]发现lncRNA n340790在甲状腺癌中差异性高表达，并且能够通过海绵效应直接吸附miR-1254从而促进甲状腺癌细胞增殖。Luo等[13]通过对64例甲状腺癌组织进行检测后发现，lncRNA-PANDAR呈高表达趋势，并且通过细胞学体外实验证实lncRNA-PANDAR能够促进甲状腺癌细胞的增殖、侵袭能力，抑制细胞的凋亡。诸多研究均表明lncRNA在甲状腺癌中发挥了重要的调控作用。

lncRNA MEG3位于人类染色体14q32.2位置，在正常组织中具有一定表达水平[7]。而在许多肿瘤中，MEG3被发现在癌组织中表达下降[14-15]。并且通过进一步研究证实，MEG3能够通过表观遗传学在基因转录时受到甲基化水平的调控作用，因而其基因表达受到抑制[16-17]。如在胃癌研究中，miR-148a能够通过抑制DNA甲基化转移蛋白酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）从而影响MEG3的表达[18]。而随着研究的不断深入，人们发现MEG3作为一个抑癌基因不仅能够作为辅助诊断肿瘤发生的分子生物标记物，而且能够在多个层面影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。如：人们发现MEG3能够抑制膀胱细胞增殖能力的同时，也能够抑制其自噬的发生[19]。Zhang等[20]发现在宫颈癌中，MEG3能够通过发挥内源性干扰RNA的功能吸附miR-21，促进宫颈癌细胞上凋亡的发生。综上所述，lncRNA MEG3在肿瘤发生发展过程中发挥了重要的调节作用，而其对甲状腺癌的影响尚处于探索阶段。

本研究通过对68例甲状腺乳头状癌临床组织标本检测发现，MEG3在甲状腺癌中呈相对低表达水平。结合临床病理参数分析发现，MEG3的表达与TNM分期和肿瘤大小相关，与其他参数无关。再进一步细胞学实验中，本研究发现MEG3能够显著促进甲状腺乳头状癌中TPC-1细胞的增殖、侵袭和转移能力，在基因表达层面本研究通过检测发现MEG3能够显著抑制与肿瘤上皮间质化相关的基因Snai2的表达。以上结果提示MEG3对于甲状腺乳头状癌是具有抑癌作用的lncRNA，为甲状腺癌新的治疗靶点提供了有效的理论依据，但其具体的分子机制需要进一步探索与证实。

[参考文献]

[1] Davies L，Welch HG. Thyroid cancer survival in the United States：observational data from 1973 to 2005 [J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2010，136（5）：440-444.

[2] Roman BR，Morris LG，Davies L. The thyroid cancer epidemic，2017 perspective [J]. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2017，24（5）：332-336.

[3] Rao A，Rajkumar T，Mani S. Perspectives of long non-coding RNAs in cancer [J]. Mol Biol Rep，2017，44（2）：203-218.

[4] Zhang R，Hardin H，Chen J，et al. Non-Coding RNAs in Thyroid Cancer [J]. Endocr Pathol，2016，27（1）：12-20.

[5] Zhang D，Liu X，Wei B，et al. Plasma lncRNA GAS8-AS1 as a Potential Biomarker of Papillary Thyroid Carcinoma in Chinese Patients [J]. Int J Endocrinol，2017，2017：2645904.

[6] Liu N，Zhou Q，Qi YH，et al. Effects of long non-coding RNA H19 and microRNA let7a expression on thyroid cancer prognosis [J]. Exp Mol Pathol，2017，103（1）：71-77.

[7] Zhou Y，Zhang X，Klibanski A. MEG3 noncoding RNA：a tumor suppressor [J]. J Mol Endocrinol，2012，48（3）：R45-R53.endprint

[8] Kentwell J，Gundara JS，Sidhu SB. Noncoding RNAs in endocrine malignancy [J]. Oncologist，2014，19（5）：483-491.

[9] Bunch H. Gene regulation of mammalian long non-coding RNA [J]. Mol Genet Genomics，2017.doi：10.1007/s00438-017-1370-9.

[10] Zhao JJ，Hao S，Wang LL，et al. Long non-coding RNA ANRIL promotes the invasion and metastasis of thyroid cancer cells through TGF-beta/Smad signaling pathway [J]. Oncotarget，2016，7（36）：57 903-57 918.

[11] Xu B，Shao Q，Xie K，et al. The Long Non-Coding RNA ENST00000537266 and ENST00000426615 Influence Papillary Thyroid Cancer Cell Proliferation and Motility [J]. Cell Physiol Biochem，2016，38（1）：368-378.

[12] Li Q，Shen W，Li X，et al. The lncRNA n340790 accelerates carcinogenesis of thyroid cancer by regulating miR-1254 [J]. Am J Transl Res，2017，9（5）：2181-2194.

[13] Li Z，Gao B，Hao S，et al. Knockdown of lncRNA-PANDAR suppresses the proliferation，cell cycle and promotes apoptosis in thyroid cancer cells [J]. EXCLI J，2017，16：354-362.

[14] Dong Z，Zhang A，Liu S，et al. Aberrant Methylation-mediated Silencing of lncRNA MEG3 Functions as a ceRNA in Esophageal Cancer [J]. Mol Cancer Res，2017，15（7）：800-810.

[15] Zhang W，Shi S，Jiang J，et al. LncRNA MEG3 inhibits cell epithelial-mesenchymal transition by sponging miR-421 targeting E-cadherin in breast cancer [J]. Biomed Pharmacother，2017，91：312-319.

[16] Li J，Bian EB，He XJ，et al. Epigenetic repression of long non-coding RNA MEG3 mediated by DNMT1 represses the p53 pathway in gliomas [J]. Int J Oncol，2016，48（2）：723-733.

[17] Sheng X，Li J，Yang L，et al. Promoter hypermethylation influences the suppressive role of maternally expressed 3，a long non-coding RNA，in the development of epithelial ovarian cancer [J]. Oncol Rep，2014，32（1）：277-285.

[18] Yan J，Guo X，Xia J，et al. MiR-148a regulates MEG3 in gastric cancer by targeting DNA methyltransferase 1 [J]. Med Oncol，2014，31（3）：879.

[19] Ying L，Huang Y，Chen H，et al. Downregulated MEG3 activates autophagy and increases cell proliferation in bladder cancer [J]. Mol Biosyst，2013，9（3）：407-411.

[20] Zhang J，Yao T，Wang Y，et al. Long noncoding RNA MEG3 is downregulated in cervical cancer and affects cell proliferation and apoptosis by regulating miR-21 [J]. Cancer Biol Ther，2016，17（1）：104-113.endprint