芒柄花黄素对大鼠局部脑缺血再灌注损伤保护作用的初步研究

姜慈静++++++吴秋慧++++++任倩瑶++++++王勇++++++陈健++++++卢慧玲

[摘要] 目的 探讨芒柄花黄素对大鼠脑局部缺血再灌注损伤的神经保护作用。 方法 采用随机数字表法将42只SD雄性大鼠分为假手术组、缺血再灌注组和芒柄花黄素组，每组14只。芒柄花黄素组腹腔注射芒柄花黄素溶液20 mg/kg，假手术组和缺血再灌注组注射等剂量生理盐水，连续7 d。线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血时间1.5 h。再灌注后24 h各组分别进行神经功能缺损测定；干/湿重法检测脑水肿程度；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色计算脑梗死体积并检测血浆超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）水平。 结果 与缺血再灌注组比较，芒柄花黄素组大鼠神经功能缺损评分降低，第二脑片梗死体积和第三脑片水肿程度减轻，血浆SOD活性提高，MDA水平下降，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 芒柄花黄素可改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损程度，减小脑梗死体积，其机制可能与减低氧化应激水平有关。

[关键词] 芒柄花黄素；脑缺血再灌注损伤；植物雌激素；神经功能缺损

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of formononetin on local cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods According to the random number table method， 42 male SD rats were divided into sham group， ischemia-reperfusion group and formononetin group， with 14 rats in each group. The formononetin group was given formononetin solution 20 mg/kg by intraperitoneal injection， the sham group and ischemia-reperfusion group were injected with same dose of normal saline， for 7 days. Suture-occluded method was used to copy the model of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury in middle cerebral artery， the ischemic time was 1.5 h. After reperfusion for 24 h， the neurologic impairment of all groups was detected； the dry/wet method was used to detect the degree of cerebral edema； 2，3，5-tripheyltetrazolium （TTC） staining was used to calculate the volume of cerebral infarction and detect the activities of plasma superoxide dismutase （SOD） and the levels of malondialdehyde （MDA）. Results Compared with ischemia-reperfusion group， the score of neurologic impairment in formononetin group was decreased， the volume of cerebral infarction of the second brain slice and the degree of cerebral edema of the third brain slice were reduced， the activities of plasma SOD were increased， and the levels of MDA were declined， the differences were all statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Formononetin can improve the degree of neurologic impairment， reduce the volume of cerebral infarction， the mechanism may be related to the decrease of oxidative stress.

[Key words] Formononetin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Phytoestrogen； Neurologic impairment

雌激素對脑缺血再灌注损伤有保护作用，但雌激素替代治疗可能增加乳腺癌和子宫癌的发病率，这使雌激素的应用受到争议[1-2]。植物雌激素被认为性质更为温和，副作用小于雌激素。芒柄花黄素（formononetin）是黄芪、鸡血藤、红三叶草等多种中药的有效成分之一，其异黄酮结构具有植物雌激素（phytoestrogen）作用。本研究通过线栓法复制大鼠局部脑缺血再灌注模型，探讨芒柄花黄素是否能够降低大鼠神经损伤和脑梗死程度，起到神经保护作用。

1 材料与方法endprint

1.1 材料

芒柄花黄素（纯度>98%）购自Phytomaker有限公司，200 mmol/L溶于DMSO，保存在4℃环境维持性状稳定。作用于动物终浓度<0.5%。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及相关试剂盒购自南京建成生物工程研究所。线栓购自广州佳灵生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组与给药

SPF级雄性SD大鼠，3月龄，重量250～280 g，由桂林医学院实验动物中心提供（合格证号SCXK桂2003-0001），20～24℃恒温饲养。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、缺血再灌注组和芒柄花黄素组，每组14只。芒柄花黄素组大鼠腹腔注射芒柄花黄素溶液，用量20 mg/kg，假手术组和缺血再灌注组注射同等剂量生理盐水，连续7 d。

1.3 动物模型制备

大鼠术前禁食、不禁水12 h，7.5%水合氯醛麻醉。采用线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉阻塞模型。小心分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉及颈总动脉近心端。线栓从颈总动脉进入颈内动脉，其起始端距离颈动脉分叉处18～20 mm，阻塞大脑中动脉血流。缺血1.5 h后，拔出线栓恢复血流，即复制缺血再灌注组模型。芒柄花黄素组模型与缺血再灌注组相同，假手术组仅分离颈部血管，未插入线栓。

1.4 神经功能缺损评分和大鼠筛选

再灌注后24 h进行神经功能缺损评分。评分标准[3]如下：0分，无神经功能缺损症状；1分，提尾不能完全伸展对侧前爪；2分，行走时向瘫痪侧转圈；3分，向瘫痪侧倾倒；4分，意识丧失。本实验只选取评分在1～2分的大鼠进行进一步操作，同时剔除脑底部有出血或明显血栓的大鼠，补足动物直到达到实验所需数量。

1.5 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

评分后处死大鼠取脑。脑组织快速冷冻约20 min，从额极向后连续取5个冠状脑片，切片厚度约2 mm。病变部位主要集中在第二、第三脑片。取第二脑片置于1% TTC染色液中37℃避光水浴30 min，正常脑组织的琥珀酸脱氢酶与TTC反应而呈红色，梗死区域因脱氢酶活性下降不反应而呈白色。使用图片处理系统Image J测量脑梗死区上下面积（S1、S2），并计算脑梗死体积。

1.6 脑组织含水量测定

取第三脑片在电子天平上称重（湿重），然后置于80℃烘箱烘干至恒重，再次称重（干重），脑组织含水量（%）=（脑组织湿重-脑组织干重）/脑组织湿重×100%。

1.7 抗氧化指标检测

再灌注24 h后麻醉后心臟取血，静置20 min，离心半径8 cm，3500 r/min，离心10 min分离出血清。WST-1法检测血浆超氧化物歧化酶（SOD）活力，TBA法检测丙二醛（MDA）含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 15.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芒柄花黄素对大鼠神经功能、脑梗死体积和脑含水量的影响

缺血再灌注组和芒柄花黄素组大鼠TTC染色显示不同程度白色梗死区，假手术组未见梗死，TTC染色为红色（图1）。与缺血再灌注组比较，芒柄花黄素组大鼠再灌注24 h神经功能评分降低（P < 0.05），第二脑片梗死体积减少（P < 0.01），第三脑片含水量降低（P < 0.05）。见表1。

2.2 芒柄花黄素对大鼠血浆氧化应激指标的影响

芒柄花黄素组血浆SOD活力高于缺血再灌注组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。缺血再灌注组、芒柄花黄素组大鼠血浆MDA水平均高于假手术组（P < 0.01），芒柄花黄素组血浆MDA水平低于缺血再灌注组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

3 讨论

芒柄花黄素基本结构为7-羟基-4'-甲氧基异黄酮，属于黄酮类植物雌激素，与其同类的包括大豆异黄酮、染料木黄酮、毛蕊异黄酮等[4]。芒柄花黄素具有类似雌激素的多种生物活性，如抑制食源性肥胖和骨质疏松[5]、作为联合用药治疗贫血[6]、抑制炎性反应[7-8]等等，同时有诱导肿瘤细胞凋亡[9]、抑制肿瘤细胞生长[10]等作用，也能够通过上调eNOS改善动脉内皮功能[11]。

本研究探索芒柄花黄素是否具有局部脑缺血保护作用。24 h神经功能评分显示芒柄花黄素组神经功能缺损情况比缺血再灌注组减轻（P < 0.05），实验结果与毛蕊异黄酮对大鼠神经功能改善结果相似[12]，毛蕊异黄酮在化学结构与芒柄花黄素仅相差在B环多了一个羟基，又被称为3′-羟基芒柄花黄素，中高剂量的毛蕊异黄酮灌胃能够降低大鼠缺血2 h再灌注24 h的18分制神经功能评分。另有资料显示，大豆异黄酮能够改善记忆障碍大鼠14 d后的水迷宫学习记忆能力[13]。鹰嘴豆异黄酮可以改善半乳糖导致的小鼠衰老模型学习记忆能力[14]。芒柄花黄素体外实验也显示[15]，芒柄花黄素预处理（10 μmol/L）12 h显著减少N-甲基-D-天冬氨酸暴露引起的皮质神经元细胞损失，特别是早期细胞凋亡。本研究使用TTC染色法检测第二脑片脑梗死情况，结果显示，与缺血再灌注组比较，脑梗死体积芒柄花黄素组有明显降低，第三脑片脑水肿程度芒柄花黄素组也比缺血再灌注组减轻。不同脑缺血模型资料显示[16-17]，使用芒柄花黄素灌胃或饮食摄取可以减轻全脑或局部脑缺血的梗死程度和水肿情况。侯进义等[18]对去势雌性大鼠进行雌激素预处理，发现可以减轻脑水肿和血脑屏障通透性，该论文认为雌激素上调相关蛋白表达有关。从以上资料来看，芒柄花黄素的神经保护作用可能是其植物雌激素效应的一部分。endprint

在体外实验中，芒柄花黄素被认为具有抗氧化功能。一项关于黄芪异黄酮提取物（包括芒柄花黄素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮等）对PC12细胞的氧化保护实验研究显示[19]，芒柄花黄素防止SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）活性的降低，并且阻止GSH的大量丢失。芒柄花黄素对邻苯三酚氧产生的超氧阴离子和由邻二氮菲-Fe2+/H2O2体系产生的羟自由基也有抑制和清除的作用[20]。本研究中芒柄花黄素组大鼠血浆MDA水平减低，SOD活性增高，提示芒柄花黄素能够增强脑缺血大鼠抗氧化水平，减轻氧化应激损伤，这与芒柄花黄素减少大鼠脑梗死体积、改善神经功能评分和脑水肿程度相一致。芒柄花黄素作为一种来源广泛的植物活性药物，对大鼠脑缺血的保护作用将为脑缺血性疾病的预防和治疗提供新的方向，但其上下游具体发生机制尚需进一步探索。

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