青海茶卡盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源分析

王小英， 刘国红， 刘 波， 陈 峥， 潘志针， 朱育菁， 王阶平， 唐建阳

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

青海茶卡盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源分析

王小英1， 刘国红2， 刘 波2， 陈 峥2， 潘志针2， 朱育菁2， 王阶平2， 唐建阳2

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

采用3种不同的培养基， 通过可培养法， 从青海茶卡盐湖样品中共分离获得110株嗜盐碱芽胞杆菌. 基于16S rRNA基因序列相似性鉴定及系统发育分析， 得出这些菌株为芽胞杆菌10个属的41个种， 它们与最近匹配模式菌株的16S rRNA基因序列相似性在96%～100%之间， 以芽胞杆菌属为优势菌， 共计25种83株； 存在6个潜在新种. 3种酶筛实验结果表明， 87%的嗜盐碱芽胞杆菌菌株具有产酶能力， 产蛋白酶70株， 产纤维素酶81株， 产木聚糖酶50株. 青海茶卡盐湖中的芽胞杆菌种类丰富多样且能产多种酶， 并且潜藏着新的微生物物种， 研究结果可为嗜盐碱芽胞杆菌资源开发提供理论基础.

嗜盐碱芽胞杆菌； 蛋白酶； 纤维素酶； 木聚糖酶; 青海省； 茶卡盐湖

0 引言

嗜盐碱芽胞杆菌是一类重要的微生物资源， 因长期受到盐碱性条件的压迫而具有独特的生理特性， 可以产生多种碱性酶类资源[1]， 如碱性蛋白酶、 碱性果胶酶、 碱性淀粉酶、 碱性纤维素酶及碱性木聚糖酶等， 广泛应用于洗涤、 造纸、 制造皮革等行业[2-4]. 近年来， 嗜盐碱芽胞杆菌的嗜盐碱机理[5]、 多样性[6-8]、 碱性酶类及其应用[9]等都已成为研究热点.

茶卡盐湖位于青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县茶卡镇附近， 是柴达木盆地有名的天然结晶盐湖. 茶卡盐湖具有高盐碱环境和独特的地理气候特征， 因而蕴藏着丰富的嗜盐碱微生物资源. 洒威等[10]从青海茶卡盐湖中获得2株在pH值为 10条件下生长的极端嗜盐碱真菌； 柴丽红等[11]应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析青海柯柯盐湖与茶卡盐湖土壤样品的细菌多样性, 初步发现这两相邻盐湖的细菌均表现出丰富的多样性且相互间具有较大差异性； 沈硕等[12]从青海茶卡盐湖及察尔汗盐湖中分离到200株嗜盐菌并从中初步筛选到20株能够抑制植物病原菌， 结果发现这些嗜盐菌对辣椒疫霉具有较强的抑制作用， 但目前尚未见关于青海茶卡盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源多样性分析的研究报道. 为了较完整地了解青海茶卡盐湖中嗜盐碱芽胞杆菌种群的多样性， 本研究采用3种不同的培养基从茶卡盐湖样品中分离嗜盐碱芽胞杆菌， 同时分析其产酶多样性， 为后期嗜盐碱芽胞杆菌的资源开发利用提供菌种来源.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

样品采集于2015年8月23日青海省茶卡盐湖中， 装入无菌采集袋并进行编号(01、 02、 03、 04、 05、 06)， 带回实验室立即进行分离.

1.1.2 分离和酶筛培养基

Horikoshi-I 培养基[13]： 葡萄糖10.0 g， 蛋白胨5.0 g， 酵母浸出物5.0 g， K2HPO41.0 g， MgSO40.2 g， Na2CO310.0 g(单独灭菌)， 琼脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值为 9.0. 改良LB-I培养基(75.0 g·L-1NaCl)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出物5.0 g， NaCl 75.0 g， 琼脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值为 9.0. 改良LB-II培养基(150.0 g·L-1NaCl)： 胰蛋白胨10.0 g， 酵母浸出物5.0 g， NaCl 150.0 g， 琼脂15～20 g， 水1 000 mL， pH 值为9.0. 以上培养基均置于高压蒸汽灭菌锅中， 121 ℃灭菌20 min.

纤维素酶筛选培养基： 酵母浸出物10.0 g， NaCl 5.0 g， 胰蛋白胨10.0 g， 羧甲基纤维素钠10.0 g， 琼脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值为 9.0. 显色试剂[14]： 2 g KI+1 g I2+300 mL水. 蛋白酶筛选培养基： 牛肉浸膏3.0 g， 蛋白胨10.0 g， NaCl 5.0 g， 脱脂奶粉20 g， 水1 000 mL， 琼脂15～20 g， pH 值为9.0， 奶粉与琼脂分开灭菌. 木聚糖酶筛选培养基： 木聚糖5 g， 琼脂15～20 g， 水1 000 mL， pH值为 9.0. 以上培养基均置于高压蒸汽灭菌锅中， 121 ℃灭菌20 min， 奶粉灭菌条件为115 ℃， 15 min.

1.1.3 主要试剂和仪器

细菌通用16S rRNA引物27F及1492R由上海铂尚生物技术有限公司合成. PCR反应试剂： 10×Buffer、 dNTP(10 mmol·L-1(each))、Taq酶(2.5 U·μL-1)购自上海铂尚生物技术有限公司， 100 bp Marker购自上海英骏生物技术有限公司. DNA提取试剂： 100 mmol·L-1NaCl， 10 mmol·L-1Tris/HCl， 1 mmol·L-1EDTA， Tris饱和酚(pH 值为8.0).

仪器包括UVP GelDoc-It TS Imaging System凝胶成像仪(美国UVP公司)、 Tpersonal Biometra梯度PCR仪(华粤行仪器有限公司)、 PowerPac Basic BIO-RAD电泳仪(美国Bio-Rad公司)、 Eppendorf Centrifuge 5418R离心机(德国艾本德公司)等.

1.2 实验方法

1.2.1 嗜盐碱芽胞杆菌的资源分离与鉴定

芽胞杆菌的分离参考刘国红等[15]的描述方法. 采用苯酚-氯仿法提取芽胞杆菌基因组DNA. 采用细菌通用引物进行PCR扩增， 扩增产物由上海铂尚生物技术有限公司完成测序工作. 通过EZtaxon-e[16]进行菌株16S rRNA基因序列分析， 利用Mega 6.0构建系统发育树[17-18].

1.2.2 嗜盐碱芽胞杆菌资源的酶活分析

采用透明圈法[19]， 用无菌牙签刮取适量菌体分别点接于各种酶的筛选培养基， 30 ℃培养2 d观察平板上产透明圈情况.

2 结果与分析

2.1 嗜盐碱芽胞杆菌资源的分离

采用3种不同培养基从青海茶卡盐湖6份样品中共分离获得了110株嗜盐碱芽胞杆菌， 其中Horikoshi-I培养基中分离到58株， LB-I培养基中有35株， LB-II培养基中仅有17株， Horikoshi-I培养基分离到的嗜盐碱芽胞杆菌数量最多. 这些嗜盐碱芽胞杆菌多数菌落偏小， 颜色主要有黄色、 乳白色， 少数为金黄色， 圆形不透明， 表面光滑湿润或粘稠状态居多， 干燥粗糙者偏少， 边缘形态有整齐、 不规则、 锯齿形， 菌落高度绝大多数为隆起状， 扁平状较少.

2.2 嗜盐碱芽胞杆菌的分子鉴定

经16S rRNA基因序列鉴定， 不同培养基分离到的嗜盐碱芽胞杆菌种类不同(见表1). Horikoshi-I培养基分离到5个属、 26个种， LB-I培养基(75.0 g·L-1NaCl)分离到5个属、 16个种， LB-II培养基(150.0 g·L-1NaCl)分离到6个属、 10个种. 经统计可得， 3种培养基共分离获得的芽胞杆菌存在部分重复， 隶属于10个属41个种， 分别为居盐水芽胞杆菌属(Aquisalibacillus)(1种3株)、 芽胞杆菌属(Bacillus)(25种83株)、 房间芽胞杆菌属(Domibacillus)(1种1株)、 纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)(2种2株)、 喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)(3种7株)、 咸海鲜芽胞杆菌属(Jeotgalibacillus)(1种1株)、 大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)(3种7株)、 类芽胞杆菌属(Paenibacillus)(1种1株)、 深海芽胞杆菌属(Thalassobacillus)(1种2株)、 枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)(3种3株).

在Horikoshi-I与LB-I培养基上都能够生长的种类有： 海水芽胞杆菌(Bacillusaquimaris)、 深褐芽胞杆菌(Bacillusatrophaeus)、 环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、Bacilluscrassostreae、 堀越氏芽胞杆菌(Bacillushorikoshii)、 地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、 假坚强芽胞杆菌(Bacilluspseudofirmus)及短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus). 在LB-I与LB-II培养基上都能够生长的种类有： 岸喜盐芽胞杆菌(Halobacilluslitoralis). 在3种培养基上都能生长的种类有： 图画大洋芽胞杆菌(Oceanobacilluspicturae). 其余的种类只在3种培养基中的任意一种上分离获得.

表1嗜盐碱芽胞杆菌的16SrRNA基因鉴定与产酶活性

序号培养基类型菌株编号最近匹配中文名称相似性/%序列号蛋白酶(H/C)纤维素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)1H-IFJAT-44622Bacilluspolygoni蓼属芽胞杆菌98．37KU95560005．403．922H-IFJAT-44623Bacilluspseudofirmus假坚强芽胞杆菌98．72KU95560105．584．703H-IFJAT-44624Bacilluspseudofirmus假坚强芽胞杆菌98．05KU95560204．133．834H-IFJAT-44625Bacilluscirculans环状芽胞杆菌98．80KU95560309．233．885H-IFJAT-44626Bacillussimplex简单芽胞杆菌99．86KU9556042．392．0306H-IFJAT-44627Domibacillusenclensis国化室房间芽胞杆菌100KU95560502．5007H-IFJAT-44629Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞杆菌99．78KU9556061．63008H-IFJAT-44630Bacillussimplex简单芽胞杆菌99．79KU9556071．98009H-IFJAT-44631Oceanobacilluspicturae图画大洋芽胞杆菌99．93KU95560800010H-IFJAT-44632Oceanobacillusprofundus深层大洋芽胞杆菌100KU95560902．63011H-IFJAT-44633Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556103．332．91012H-IFJAT-44634Bacillusaerius空气芽胞杆菌100KU9556112．462．242．8313H-IFJAT-44635Bacillusdrentensis钻特省芽胞杆菌97．84KU95561200014H-IFJAT-44636Bacillussafensis沙福芽胞杆菌100KU9556132．360015H-IFJAT-44637Bacillusaerius空气芽胞杆菌100KU9556141．812．432．3416H-IFJAT-44638Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556153．932．343．5417H-IFJAT-44639Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．92KU9556163．412．77018H-IFJAT-44640Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞杆菌99．93KU9556171．3300

续表1

序号培养基类型菌株编号最近匹配中文名称相似性/%序列号蛋白酶(H/C)纤维素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)19H-IFJAT-44641Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞杆菌99．93KU9556182．650020H-IFJAT-44642Bacillusoceanisediminis海洋沉积芽胞杆菌99．93KU95561901．89021H-IFJAT-44643Bacillussafensis沙福芽胞杆菌100KU9556203．210022H-IFJAT-44644Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．64KU9556214．232．363．7023H-IFJAT-44645Bacillussalsus好盐芽胞杆菌99．86KU95562204．88024H-IFJAT-44646Bacillusthuringiensis苏云金芽胞杆菌99．57KU9556231．892．313．3225H-IFJAT-44647Bacillushalmapalus盐敏芽胞杆菌99．29KU95562402．07026H-IFJAT-44648Bacilluslicheniformis地衣芽胞杆菌98．92KU95562502．04027H-IFJAT-44649Bacillussalsu好盐芽胞杆菌99．78KU95562605．47028H-IFJAT-44650Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556273．421．862．6329H-IFJAT-44651Bacillus frigoritolerans耐寒芽胞杆菌99．57KU9556283．312．611．6130H-IFJAT-44652Bacillushalmapalus盐敏芽胞杆菌99．15KU9556291．901．73031H-IFJAT-44653Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞杆菌99．93KU9556302．301．27032H-IFJAT-44654Bacillusaquimaris海水芽胞杆菌99．29KU9556312．684．883．6533H-IFJAT-44655Bacillusaquimaris海水芽胞杆菌99．50KU9556323．092．972．3234H-IFJAT-44656Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556333．311．652．8235H-IFJAT-44657Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌99．08KU9556341．702．242．3336H-IFJAT-44658Gracilibacillusthailandensis泰国纤细芽胞杆菌98．90KU95563502．237．0337H-IFJAT-44659Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．86KU9556364．104．143．1038H-IFJAT-44660Bacillushalmapalus盐敏芽胞杆菌99．15KU9556372．321．63039H-IFJAT-44661Bacillussimplex简单芽胞杆菌99．64KU9556384．010040H-IFJAT-44662Bacilluslicheniformis地衣芽胞杆菌98．85KU9556391．581．671．6341H-IFJAT-44663Bacilluscrassostreae100KU9556404．133．623．8542H-IFJAT-44664Bacillusalcalophilus嗜碱芽胞杆菌98．69KU9556411．950043H-IFJAT-44665Bacillussubtilis枯草芽胞杆菌99．93KU9556423．732．60044H-IFJAT-44666Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556433．352．77045H-IFJAT-44667Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556444．482．53046H-IFJAT-44668Bacillusfrigoritolerans耐寒芽胞杆菌100KU9556452．321．36047H-IFJAT-44669Bacillusoceanisediminis海洋沉积芽胞杆菌99．93KU95564601．98048H-IFJAT-44670Bacillusalkalisediminis碱性沉积芽胞杆菌99．08KU95564703．54049H-IFJAT-44671Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556484．922．49050H-IFJAT-44672Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌98．04KU9556492．582．19051H-IFJAT-44673Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌98．93KU9556502．771．92052H-IFJAT-44674Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556513．311．902．4553H-IFJAT-44675Bacilluspumilus短小芽胞杆菌99．85KU9556522．310054H-IFJAT-44676Bacilluspumilus短小芽胞杆菌99．79KU9556532．550055H-IFJAT-44677Bacillusoceanisediminis海洋沉积芽胞杆菌99．93KU95565401．632．4756H-IFJAT-44678Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556553．462．422．8657H-IFJAT-44679Bacillusaquimaris海水芽胞杆菌99．22KU95565602．953．5258H-IFJAT-44680Paenibacilluslautus灿烂类芽胞杆菌99．49KU95565702．86无59LB-IFJAT-44689Virgibacillussalexigens需盐枝芽胞杆菌98．14KU9556582．14-060LB-IFJAT-44690Bacilluscirculans环状芽胞杆菌99．30KU95565905．31061LB-IFJAT-44691Bacilluspseudofirmus假坚强芽胞杆菌99．31KU9556603．912．27062LB-IFJAT-44692Bacilluscohnii科恩芽胞杆菌98．70KU95566101．82063LB-IFJAT-44693Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌99．22KU9556623．322．432．2864LB-IFJAT-44694Bacilluscohnii科恩芽胞杆菌99．79KU95566302．72065LB-IFJAT-44695Bacillusflexus弯曲芽胞杆菌99．93KU9556642．783．832．97

续表1

序号培养基类型菌株编号最近匹配中文名称相似性/%序列号蛋白酶(H/C)纤维素酶(H/C)木聚糖酶(H/C)66LB-IFJAT-44696Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556654．122．585．8667LB-IFJAT-44697Bacilluslicheniformis地衣芽胞杆菌99．79KU9556662．092．352．6768LB-IFJAT-44698Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556674．862．185．5069LB-IFJAT-44699Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556684．222．875．0570LB-IFJAT-44700Bacilluspumilus短小芽胞杆菌99．79KU9556693．9804．6971LB-IFJAT-44701Bacillusaquimaris海水芽胞杆菌99．57KU9556702．422．624．0072LB-IFJAT-44702Oceanobacilluspicturae图画大洋芽胞杆菌99．86KU95567102．833．7573LB-IFJAT-44703Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556724．772．577．4974LB-IFJAT-44704Bacillusaquimaris海水芽胞杆菌99．22KU9556733．321．932．7375LB-IFJAT-44705Oceanobacilluspicturae图画大洋芽胞杆菌99．36KU9556745．232．079．4376LB-IFJAT-44706Halobacilluslitoralis岸喜盐芽胞杆菌99．79KU95567504．06077LB-IFJAT-44707Bacillusboroniphilus嗜硼芽胞杆菌100KU9556763．783．183．4578LB-IFJAT-44708Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌99．81KU9556772．091．782．0979LB-IFJAT-44709Bacilluspumilus短小芽胞杆菌99．86KU955678004．0580LB-IFJAT-44710Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．79KU9556793．992．026．8481LB-IFJAT-44711Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556804．032．366．2982LB-IFJAT-44712Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556813．602．636．7383LB-IFJAT-44713Bacillushorikoshii堀越氏芽胞杆菌99．43KU9556823．332．103．1884LB-IFJAT-44714Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．50KU9556833．991．856．1485LB-IFJAT-44715Bacilluspumilus短小芽胞杆菌99．79KU9556843．6403．9186LB-IFJAT-44716Bacilluscohnii科恩芽胞杆菌99．79KU95568502．22087LB-IFJAT-44717Bacilluslicheniformis地衣芽胞杆菌99．19KU9556861．961．662．3788LB-IFJAT-44718Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556872．972．555．4989LB-IFJAT-44719Bacillusagaradhaerens黏琼脂芽胞杆菌99．93KU95568800090LB-IFJAT-44720Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556893．202．267．0791LB-IFJAT-44721Bacillusatrophaeus深褐芽胞杆菌99．93KU9556905．713．097．0992LB-IFJAT-44722Jeotgalibacilluscampisalis盐地咸海鲜芽胞杆菌99．29KU9556911．811．542．1693LB-IFJAT-44723Bacilluscrassostreae99．68KU9556924．763．852．7494LB-IIFJAT-45313Halobacilluslitoralis岸喜盐芽胞杆菌99．09KU9556931．401．45095LB-IIFJAT-45314Virgibacilluszhanjiangensis湛江枝芽胞杆菌100KU9556941．621．26096LB-IIFJAT-45315Thalassobacillusdevorans食有机物深海芽胞杆菌99．86KU9556952．491．50097LB-IIFJAT-45316Gracilibacillusorientalis东边纤细芽胞杆菌100KU95569601．83098LB-IIFJAT-45317Halobacilluslitoralis岸喜盐芽胞杆菌99．72KU9556971．930099LB-IIFJAT-45318Thalassobacillusdevorans食有机物深海芽胞杆菌99．65KU95569801．680100LB-IIFJAT-45319Virgibacillusnatechei＇盐反硝化枝芽胞杆菌96．75KU955699000101LB-IIFJAT-45320Oceanobacillusmanasiensis玛纳斯大洋芽胞杆菌99．16KU955700000102LB-IIFJAT-45321Halobacillusprofundi深海喜盐芽胞杆菌99．65KU955701000103LB-IIFJAT-45322Halobacillusdabanensis岸喜盐芽胞杆菌99．65KU955702000104LB-IIFJAT-45323Halobacillusdabanensis岸喜盐芽胞杆菌99．44KU955703000105LB-IIFJAT-45324Oceanobacilluspicturae图画大洋芽胞杆菌99．93KU955704000106LB-IIFJAT-45325Aquisalibacilluselongatus延伸居盐水芽胞杆99．79KU955705000107LB-IIFJAT-45326Aquisalibacilluselongatus延伸居盐水芽胞杆99．79KU955706000108LB-IIFJAT-45327Halobacilluslitoralis岸喜盐芽胞杆菌98．94KU955707000109LB-IIFJAT-45328Aquisalibacilluselongatus延伸居盐水芽胞杆99．64KU955708000110LB-IIFJAT-45329Oceanobacilluspicturae图画大洋芽胞杆菌99．21KU955709000

注： H-I表示Horikoshi-I培养基； 0表示不产酶

2.3 嗜盐碱芽胞杆菌新种资源的系统发育分析

Kim等[20]报道了16S rRNA基因序列相似性低于98.65%时， 可判断为不同的种的潜在新种资源. 由表1可知， 菌株FJAT-44622、 FJAT-44624、 FJAT-44635、 FJAT-44672、 FJAT-44689及FJAT-45319的16S rRNA基因序列相似性均小于98.37%， 可能为潜在新种， 该6株嗜盐碱芽胞杆菌的系统发育树见图1. 由图1可知， 这6株嗜盐碱芽胞杆菌分为3群.

第一群为芽胞杆菌属rRNA group 6， 包含2种潜在新种， 其中FJAT-44622与蓼属芽胞杆菌(BacilluspolygoniYN-1T)的亲缘关系最近， 16S rRNA基因序列相似性达98.37%， FJAT-44624与假坚强芽胞杆菌(BacilluspseudofirmusDSM 8715T)的16S rRNA基因序列相似性达98.05%.

第二群为枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)， 包含2种潜在新种， 其中FJAT-45319与盐反硝化枝芽胞杆菌(VirgibacillusnatecheiFarDT)的16S rRNA基因序列相似性达96.75%， FJAT-44689与需盐枝芽胞杆菌(VirgibacillussalexigensC-20MoT)的16S rRNA基因序列相似性达98.14%.

第三群为芽胞杆菌属rRNA group 1和group 6， 包含2种潜在新种， 其中FJAT-44635独立构成一个分支， 与钻特省芽胞杆菌(BacillusdrentensisLMG 21831T)的16S rRNA基因序列相似性达97.84%， FJAT-44672与堀越氏芽胞杆菌(BacillushorikoshiiDSM 8719T)的16S rRNA基因序列相似性达98.04%.

图1 青海省茶卡盐湖中潜在芽胞杆菌新种的系统发育树Fig.1 Pylogeney of potential new Bacillus species isolated from Qinghai Chaka Salt Lake

2.4 嗜盐碱芽胞杆菌资源的酶活分析

实验结果见表1. 从110株嗜盐碱芽胞杆菌中筛选到96个产酶菌株， 其中70株产蛋白酶(见图2)， 深褐芽胞杆菌(B.atrophaeus)FJAT-44721的H/C值高达5.71； 81株产纤维素酶(见图3)， 环状芽胞杆菌(B.circulans)FJAT-44625的H/C值高达9.23； 50株产木聚糖酶(见图4)， 图画大洋芽胞杆菌(Oceanobacilluspicturae)FJAT-44705的H/C值高达9.43.

由表1可知， 能同时产蛋白酶、 纤维素酶、 木聚糖酶3种酶的芽胞杆菌有6种， 它们是空气芽胞杆菌(Bacillusaerius)(2株)、 嗜硼芽胞杆菌(Bacillusboroniphilus)(1株)、B.crassostreae(2株)、 弯曲芽胞杆菌(Bacillusflexus)(1株)、 苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)(1株)及盐地咸海鲜芽胞杆菌(Jeotgalibacilluscampisalis)(1株). 能同时产蛋白酶、 纤维素酶2种酶的芽胞杆菌有6种， 它们是深褐芽胞杆菌(B.atrophaeus)(23株)、 食有机物深海芽胞杆菌(Thalassobacillusdevorans)(2株)及湛江枝芽胞杆菌(Virgibacilluszhanjiangensis)(1株)、 枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)(1株)、 堀越氏芽胞杆菌(Bacillushorikoshii)(6株)、 深褐芽胞杆菌(B.atrophaeus)(23株). 能同时产纤维素酶及木聚糖酶的芽胞杆菌有4种， 它们是蓼属芽胞杆菌(Bacilluspolygoni)(1株)、 泰国纤细芽胞杆菌(Gracilibacillusthailandensis)(1株)、 海水芽胞杆菌(B.aquimaris)(5株)、 海水芽胞杆菌(Bacillusaquimaris)(5株). 其余芽胞杆菌仅能产这3种酶中的一种酶或是不产这3种酶.

图2 菌株产蛋白酶情况 图3 菌株产纤维素酶情况 图4 菌株产木聚糖酶情况Fig.2 Protease-producing activity Fig.3 Cellulase-producing activity Fig.4 Xylanase-producing activity

3 讨论

1) 盐湖嗜盐碱芽胞杆菌分离培养基的选择. 不同成分、 不同盐质量浓度的培养基分离到的嗜盐碱芽胞杆菌种类不同， 随着盐质量浓度的升高， 分离到的芽胞杆菌种数呈减少的趋势， Horikoshi-I培养基最多， LB-I培养基(75.0 g·L-1NaCl)次之， LB-II培养基(150.0 g·L-1NaCl)最少， 说明青海茶卡盐湖地区的高盐碱土壤环境中嗜盐碱芽胞杆菌的多样性低于中度盐分和低度盐分的盐碱土壤； 而总菌落数则相反， 高盐碱的土壤环境中嗜盐碱芽胞杆菌总菌落数高于中低盐碱的， 该结果与王建明等[21]对塔里木盆地荒漠盐碱生境嗜(耐)盐碱细菌的研究结果相反. 盐湖嗜盐碱芽胞杆菌采用Horikoshi-I培养基分离效果最好， 分离的种类多， 与王建明等[21]的研究结果相同. 本实验发现， 在NaCl质量浓度75.0～150.0 g·L-1范围内， 分离获得的芽胞杆菌数量约占总数的50%， 表明该地区有近半数的芽胞杆菌资源对高盐环境具有较高的耐受力， 该结果与杜传英等[22]对东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计的结果相同. 综上表明， 培养基盐碱条件是选择合适分离嗜盐碱芽胞杆菌培养基需考虑的重要因素.

2) 盐湖嗜盐碱芽胞杆菌鉴定. 16S rRNA基因是原核生物分类地位判断的黄金指标之一， 当两株菌之间16S rRNA基因序列相似性低于98.65%时， 可认为是两种不同的种[20]. 通过16S rRNA基因序列分析， 本研究分离获得的110株嗜碱芽胞杆菌初步鉴定为10个属、 41个种， 其中25个种隶属于芽胞杆菌属. 16S rRNA基因序列系统发育分析表明存在6个潜在的芽胞杆菌新种， 它们与最近匹配模式菌株的16S rRNA基因序列相似性皆低于98.65%. 根据Logan等[23]和Tindall等[24]描述的产芽胞细菌新种鉴定标准， 需要进一步进行分类学研究方可确定其准确的分类地位， 潜在新种的分析有待于进一步研究.

3) 盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源多样性. 据前人研究结果表明， 我国盐碱湖中存在着丰富的芽胞杆菌资源. 与胡轶伦等[25]报道的新疆柴达布盆地盐湖、 冯伟等[26]报道的天津团泊湖、 郑贺云等[27]报道的新疆阿克苏地区盐碱地、 陈超等[28]报道的新疆七角井盐湖、 吴海平等[29]报道的新疆达坂盐湖及王陶[6]报道的新疆罗布泊的盐碱环境中分离到的嗜盐碱芽胞杆菌相比， 本研究挖掘到的芽胞杆菌属(Bacillus)、 纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、 喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)、 咸海鲜芽胞杆菌属(Jeotgalibacillus)、 大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、 类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、 深海芽胞杆菌属(Thalassobacillus)及枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)， 在上述地区也有发现. 同时， 芽胞杆菌为采样地点的优势菌群， 这与新疆柴达布盆地盐湖[25]、 天津团泊湖[26]、 新疆阿克苏地区盐碱地[27]及新疆罗布泊地区[6]分析结果一致. 本研究在青海茶卡盐湖盐碱环境中首次发现了居盐水芽胞杆菌属(Aquisalibacillus)与房间芽胞杆菌属(Domibacillus)， 表明青海茶卡盐湖中存在着丰富的嗜盐碱芽胞杆菌种群， 为挖掘嗜盐碱芽胞杆菌资源的研究提供了科学依据.

4) 盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源酶活筛选. 嗜盐碱芽胞杆菌能产生多种碱性酶， 在工业、 环保、 医学等领域具有重要的应用价值. 通过酶筛实验， 发现产酶菌株占总数的87%， 同时产3种酶的有6种， 产两种酶的有10种， 其中深褐芽胞杆菌(B.atrophaeusFJAT-44721)具有较高的产蛋白酶活性， 环状芽胞杆菌(B.circulansFJAT-44625)具有较高的产纤维素酶活性， 图画大洋芽胞杆菌(O.picturaeFJAT-44705)具有较高的产木聚糖酶活性. 陈超[28]发现新疆七角井盐湖可培养喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)具有高效的产蛋白酶能力， 而芽胞杆菌属(Bacillus)不具备产蛋白酶能力， 这与本研究中大部分芽胞杆菌属(Bacillus)具有良好的产酶能力趋势相反. 同时， 孙同毅等[30]从天津塘沽盐碱土壤中也分离到1株能产碱性蛋白酶的嗜碱芽胞杆菌(Bacillusalcalophilus)， 在一定程度上反映了嗜碱芽胞杆菌(B.alcalophilus)具有产蛋白酶的潜力. 产竹华等[31]对我国近海中度嗜盐菌进行产酶多样性分析时， 虽然未发现有产蛋白酶的芽胞杆菌种属， 但发现枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)及喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)具有产纤维素酶的能力， 本研究发现的岸喜盐芽胞杆菌(H.litoralis)与湛江枝芽胞杆菌(V.zhanjiangensis)具有产纤维素酶及蛋白酶的能力， 该结果与陈超[28]及产竹华等[31]的研究趋势相同， 从而丰富了芽胞杆菌产酶资源多样性. 孟凡旭等[32]在阿牙克库木湖分离到的嗜盐菌中未检测到纤维素酶和木聚糖酶活性， 本研究发现了一批能产纤维素酶及木聚糖酶的芽胞杆菌， 它们是蓼属芽胞杆菌(B.polygoni)、 泰国纤细芽胞杆菌(G.thailandensis)和海水芽胞杆菌(B.aquimaris). 由此可见， 青海茶卡盐湖中蕴藏着的嗜盐碱芽胞杆菌潜藏着较高的产酶能力及丰富的产酶多样性.

[1] SARETHY IP, SAXENA Y, KAPOOR A,etal. Alkaliphilic bacteria: applications in industrial biotechnology[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2011, 38(7): 769-790.

[2] 韩晓芳, 郑连爽. 嗜碱芽胞杆菌木聚糖酶在苇浆漂白中的应用初探[J]. 农业环境科学学报, 2004, 23(6): 1 144-1 146.

[3] DENG A, WU J, ZHANG Y,etal. Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease fromBacillussp. B001[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(18): 7 111-7 117.

[4] KIM DH, MORIMOTO N, SABURI W,etal. Purification and characterization of a liquefying α-amylase from alkalophilic thermophilicBacillussp. AAH-31[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2012, 76(7): 1 378-1 383.

[5] PADAN E, BIBI E, ITO M,etal. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights[J]. Biochimica Et Biophysica Acta Biomembranes, 2005, 1 717 (2): 67-88.

[6] 王陶. 罗布泊可培养嗜碱细菌多样性及产酶特性研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2009.

[7] 石伟. 极端盐碱土壤细菌的分离筛选及抗盐特性研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2011.

[8] ZHAI L, MA Y, XUE Y,etal.Bacillusalkalicolasp. nov., an alkaliphilic, gram-positive bacterium isolated from Zhabuye Lake in Tibet, China[J]. Current Microbiology, 2014, 69(3): 311-316.

[9] FUJINAMI S, FUJISAWA M. Industrial applications of alkaliphiles and their enzymes-past, present and future[J]. Environmental Technology, 2010, 31(8/9) : 845-856.

[10] 洒威, 焦迎春. 青海茶卡盐湖中极端嗜盐碱真菌分离的研究[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(35): 16 989-16 990; 17 037.

[11] 柴丽红, 崔晓龙, 彭谦, 等. 青海两盐湖细菌多样性研究[J]. 微生物学报, 2004, 44(3): 271-275.

[12] 沈硕, 王舰. 青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探[J]. 广东农业科学, 2013, 40(1): 79-81; 88.

[13] HORIKOSHI K. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63(4): 735-750.

[14] KASANA R C, SALWAN R, DHAR H,etal. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using gram's iodine[J]. Current Microbiology, 2008, 57(5): 503-507.

[15] 刘国红, 朱育菁, 刘波, 等. 玉米根际土壤芽胞杆菌的多样性[J]. 农业生物技术学报, 2014, 22(11): 1 367-1 379.

[16] KIM O S, CHO Y J, LEE K,etal. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2012, 62(Pt3):716-721.

[17] WHITE D C, FINDLAY R H. Biochemical markers for measurement of predation effects on the biomass, community structure, nutritional status, and metabolic activity of microbial biofilms[J]. Hydrobiologia, 1988, 159(1): 119-132.

[18] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M,etal. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1 596-1 599.

[19] 曲佳. 南海局部海洋沉积物中真菌多样性及产酶活性初步研究[D]. 汉中: 陕西理工学院, 2014.

[20] KIM M, OH H S, PARK S C,etal. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2014, 64(Pt2): 346-351.

[21] 王建明, 罗晓霞, 贺江舟, 等. 塔里木盆地荒漠盐碱生境嗜盐碱细菌的初步研究[J]. 微生物学杂志, 2009, 29 (1): 79-85.

[22] 杜传英, 李海涛, 刘荣梅, 等. 东北地区耐盐芽胞杆菌筛选统计及初步鉴定[J]. 生物技术通报, 2014(10): 179-187.

[23] LOGAN N A, BERGE O, BISHOP A H,etal. Proposed minimal standards for describing new taxa of aerobic, endospore-forming bacteria[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(8): 2 114-2 121

[24] TINDALL B J, ROSSELL-MRA R, BUSSE H J,etal. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60(Pt1): 249-266.

[25] 胡轶伦. 柴达木盆地盐湖土壤微生物资源研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2015.

[26] 冯伟, 孙瑞, 高广海, 等. 天津团泊湖地区盐碱土壤中可培养微生物群落结构和归属分析[J]. 农业环境科学学报, 2013, 32(5): 1 028-1 035.

[27] 郑贺云. 新疆阿克苏地区盐碱地土壤细菌多样性及菌株的分离鉴定[D]. 阿拉尔: 塔里木大学, 2012.

[28] 陈超. 新疆七角井盐湖可培养细菌多样性及其功能酶筛选[D]. 阿拉尔: 塔里木大学, 2011.

[29] 吴海平， 王真辉， 杨礼富. 新疆达坂盐湖沉积土壤嗜盐细菌的定向富集与多样性分析[J]. 微生物学通报, 2010, 37(7): 956-961.

[30] 孙同毅, 邵伟光, 高志芹, 等. 一株产碱性蛋白酶的嗜碱芽胞杆菌的分离和鉴定[J]. 现代生物医学进展, 2008, 8(7): 1 256-1 258.

[31] 产竹华, 刘洋, 王昭凯, 等. 我国近海中度嗜盐菌的分离筛选及其产酶多样性分析[J]. 海洋学报, 2014, 36(2): 115-122.

[32] 孟凡旭, 吴敏, 张会斌, 等. 阿牙克库木湖嗜盐菌的分离及功能酶的筛选[J]. 浙江大学学报(理学版), 2006, 33(6): 671-675.

AnalysisofhalophilicandalkaliphilicBacillusresourcesfromQinghaiChakaSaltLake

WANG Xiaoying1， LIU Guohong2， LIU Bo2， CHEN Zheng2， PAN Zhizhen2， ZHU Yujing2，WANG Jieping2， TANG Jianyang2

(1. College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China；2. Agricultural Bio-resource Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350003, China)

110 halophilic and alkaliphilicBacillusstrains were isolated and cultured using three medium. Based on 16S rRNA gene similarities and phylogeny analysis, it was indicated that these halophilic and alkaliphilicBacillusstrains belonged to 10 genera including 41 species with 16S rRNA gene 96%～100% similarity to the their closed type strains. The genusBacilluswas the dominant resource in Chaka Salt Lake, which include 25Bacillusspecies including 83 strains. 6 strains may represent the potential new species. From the three enzymes screening, it was showed that approximately 87% strains could produce enzymes, among which 70 strains produced protease, 81 strains produced cellulose and 50 strains produced xylanase. The research indicated that there was not only an abundant diversity ofBacillus, which could produce many kinds of enzymes, but also some potential new microbial species in Qinghai Chaka Salt Lake, which provided basis for reasonable development of halophilic and alkaliphilicBacillusresources.

halophilic and alkaliphilicBacillus; protease; cellulose; xylanase; Qinghai Province； Chaka Salt Lake

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0761

1000-2243(2017)05-0761-09

Q939

A

2016-05-20

刘波(1957- )， 研究员， 主要从事微生物生物技术与农业生物药物研究， fzliubo@163.com

国家自然科学基金资助项目(31370059)； 福建省农业科技重大专项基金资助项目(2015NZ0003)； 福建省种业创新与产业化工程资助项目(FJZZZY-1544)； 福建省种业创新资助项目“福建芽胞杆菌资源保藏中心”； 福建省自然科学基金资助项目(2016J01129)； 福建省公益资助项目(2015R1018-7)； 青年英才计划资助项目(YJRC2015-17)

(责任编辑： 洪江星)