MTS法检测番鸭呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞活力的影响

林泽鑫

福建省平和县动物疫病预防控制中心 福建平和 363700

MTS法检测番鸭呼肠孤病毒对鸭胚成纤维细胞活力的影响

林泽鑫

福建省平和县动物疫病预防控制中心 福建平和 363700

采用MTS法检测接种不同致病力番鸭呼肠孤病毒12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h后对番鸭鸭胚成纤维细胞（MDEF）活力的影响。根据细胞病变情况和活力状态确定细胞发生变化的拐点，初步探讨番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞凋亡的发生和细胞活力的特征变化，进一步了解番鸭呼肠孤病毒与宿主之间的相互关系，为研究番鸭呼肠孤病毒感染和致病机理提供时间科学依据。结果表明，接毒后36 h，细胞活力达到最高，高致病力YB毒株作用于MDEF，细胞活力在48 h大幅下降并出现明显细胞凋亡；低致病力YJL毒株作用于MDEF，则在72 h可出现明显细胞凋亡。

MTS检测法 番鸭呼肠孤病毒 番鸭鸭胚成纤维细胞（MDEF） 细胞活力

番 鸭 呼 肠 孤 病 毒 （Muscovy duck reovirus，MDRV）可引起番鸭以肝脾出现灰白色坏死点（白点病、肝白点病、花肝病）、纤维素心包炎为主要特征的一种急性传染病，临床症状体现为番鸭软脚、腹泻、生长障碍，该病也感染鹅。番鸭呼肠孤病毒感染也是我国近年来才出现的较为流行的番鸭疫病，该病发病率高（30%～90%），致死率高（60%～80%）[1]。番鸭呼肠孤病毒引发的番鸭疫病主要发生于40日龄以下番鸭，以7～45日龄常发，且日龄越小，病死率越高，发病鸭耐过后变成僵鸭[2-3]，并且治疗该病至今无特效药。番鸭呼肠孤病毒是呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）的成员，病毒粒子呈正二十面体对称，无囊膜，有双层衣壳结构。完整的番鸭呼肠孤病毒粒子直径60～75 nm，氧化铯中的浮密度为1.36～1.37 g/mL，有空心、实心两种病毒粒子。病毒基因组为分界的双股RNA，在SDS-PAGE中，其核酸型具有禽呼肠孤病毒的特征，即由大小不同3个类别 （大节段L、中节段M和小节段S0）的10个节段组成；该病毒目前得知编码14种蛋白，其 中 结 构 蛋 白 10 种 ：λA、λB、λC、μA、μB、μBC、μBN、σC、σA、σB；非结构蛋白,4 种：μNS、P10、P17、σNS）[4]。国内外自报道番鸭呼肠孤病毒病以来，针对该病病原学、病理形态学以及分子生物学诊断及核酸序列等方面的研究已取得较大进展，但对番鸭呼肠孤病毒病的发生、发展与转归机制了解较少。本文通过检测番鸭呼肠病毒对番鸭鸭胚成纤维细胞（MDEF）活力的影响来研究感染机制，为进一步明确该病且更好地防治该病提供研究思路与研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 番鸭鸭胚 （购自莆田广东温氏家禽有限公司，由其实验室孵化）、RPMI1640粉末培养基（GIBCO 公司）、MTS 试剂盒（Promega 公司）、新生牛血清（浙江天杭生物科技）、1%双抗（青霉素、链霉素购自华北制药集团）。

1.1.2 主要器材 96孔板、CO2培养箱 （Thermo公司）、酶标仪（Thermo公司）、电热恒温箱（上海阳光实验仪器公司）、超净工作台（SW-CJ-LC标准型）、恒温水浴锅（上海精宏试验设备有限公司）、微型振荡器（上海人和科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 番鸭原代成纤维细胞的制备 在无菌条件下取出13日龄番鸭胚体，放入含有1%双抗Hanks液的培养皿中；将胚体的头部及四肢剪去，并去除胚体的心脏、肝脏、肠道等内脏器官；用hanks液将胚体冲洗干净放入20 mL青霉素瓶中；用弯头剪刀将其剪至1 mm3大小的碎块后，再次用Hanks液对组织进行洗涤 （一般需要洗两遍组织上清才能清亮）；随后用不含EDTA的0.25%胰酶对其进行37℃水浴消化（胰酶使用量一般为4 mL/胚，胰酶的体积是被消化组织体积的4倍）；水浴过程每3 min振荡1次，3次后无菌条件下取出上清 （胰酶），加入15 mL含有10%血清、1%双抗的1640培养液终止消化；用弯头滴管轻轻吹打（每枚胚需吹打15次左右即能获得理想细胞量）、静置（5～8 min）、过滤（使用灭菌过的200目细胞过滤网）；白血球计数法计数后稀释至5×105/mL，分装至培养瓶中于37℃、5%CO2培养箱中培养，待用。

1.2.2 96孔板培养细胞及培养YB株和YJL株病毒 将两毒株在胚体上重新传代是为了复壮所保存的病毒，以期恢复其原有的毒力并达到稳定；在细胞上传代培养是为了将保存的病毒株在宿主细胞增殖，大量扩增后续试验所需要的病毒，做到试验前后病毒没有差异。

1.2.2.1 两毒株在番鸭胚体上的传代 选取胚体状态正常的7日龄番鸭胚，分别在两个操作台对两毒株进行接毒。无菌条件下对胚体进行卵黄囊接种，每枚胚接种0.4 mL病毒量；用红蜡封好，置于37℃生化培养箱培养；每天翻蛋4次，照蛋3次，弃去接毒24 h内死去的胚 （认为非正常死亡）；胚死后放入4℃冰箱8 h或过夜后无菌收取胚体和尿囊液，研磨后装入20 mL青霉素瓶，-70℃冰箱保存备用。

1.2.2.2 两毒株在MDEF上传代扩增 在已经培养24 h的MDEF原代细胞上（已基本铺满单层）接毒，分别在两个超净台中进行。操作步骤如下：用弯头滴管轻轻吹打细胞表面，洗去漂浮的死亡细胞后弃上清，加入少量含有1%双抗的Hanks液再次洗涤细胞表面，尽量减少血清对病毒吸附细胞的影响；加入1 mL病毒液置于37℃、5%CO2培养箱感作45 min；尔后加入含2%血清、1%双抗的1640维持液，置于37℃、5%CO2培养箱培养，设空白对照组，每日观察病变。

1.2.3 MTS法检测接种YB毒株和YJL毒株后番鸭MDEF的活力 MTS检测方法是检测细胞增殖、细胞毒性的常用方法[5-6]。具体方法与步骤如下：（1）培养番鸭原代成纤维细胞到对数生长期。（2）取96孔细胞培养板， 每孔加 0.1 mL 含 1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。（3）每孔加0.1 mL系列稀释的待测细胞因子，在37℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24 h。（4）每孔加20 μL MTS/PMS混合液，继续培养3～4 h，显色。（5）检测前摇晃培养板 10 s，混匀颜色。在490 nm处酶联检测仪检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。

检测孔包括空白组、0加药组、加药组，空白组为只有1640培养基孔，0加药组为正常细胞未接种病毒组，加药组为接种病毒组。按照公式计算：细胞活力（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）]×100%，其中 A 为 OD 值。

2 结果与分析

选用生长状态优良的13日龄番鸭胚，制备原代成纤维细胞（6板96孔），每孔细胞数量 5×104个，分别接种YB、YJL毒株高低两个剂量梯度，记作YB-H、YB-L、YJL-H、YJL-L，接毒剂量见表1。高剂量梯度为所加病毒能够完全覆盖细胞层表面，低剂量梯度为所加病毒经过摇晃可浸过细胞层表面。于96孔细胞培养板接毒后 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h 各取一板，MTS法对1640培养液孔、空白细胞孔、YB毒株接毒孔、YJL毒株接毒孔进行DMEM活力检测，在490 nm处用酶标仪读取OD值。每组分别检测8个重复孔，去掉最高值和最低值，其余求和取平均值，即为最终的OD值，检测结果见表2。

表1 试验中选择的接毒剂量

表2 MTS法检测细胞活力（OD值）

以空白组活力最高时的A值（空白）作参照，根据公式计算细胞活力，结果见表3；并根据活力表作出组间活力比较折线图（见图1），组内活力比较柱状图（见图2）。由MTS检测得出的细胞活力折线图和组内各时间细胞活力图可以看出，空白组细胞活力从12 h至36 h呈现上升趋势。分析认为这是由于鸭胚原代成纤维细胞在该期间处于生长和少量增殖状态，成纤维细胞为终末分化细胞，不具备很高的增殖能力，与鸡胚相比，番鸭胚的成纤维细胞增殖能力更弱；36 h之后细胞活力逐渐下降，存活时间在120 h左右。

表3 各组细胞活力水平

图1 组间细胞活力折线图

图2 组内细胞活力柱状图

YJL-L组因病毒含量较少、毒力较弱，其细胞活力与空白组趋势一致，整体上细胞活力稍微低于空白组。YJL-H组、YB-L组、YB-H组细胞在生长趋势上大体一致，于36 h同样处于活力最高状态，符合病毒为了在机体内复制而激活宿主的生长因子，以更好地建立感染条件的原理；细胞活力在48 h明显下降，认为此时细胞启动凋亡机制，使相当部分感染细胞死亡，造成活力下降；72 h可检测到活力有小幅提升，分析认为因细胞凋亡使部分病毒被消灭，使得其他细胞受病毒感染的比例减少，显示细胞凋亡对机体的积极意义，由于受到过多病毒的感染，细胞凋亡数量较大，使机体免疫受到抑制，细胞仍有死亡，因而在96 h依然出现活力下降的明显现象。YJL-H组整体而言活力高于YB组，分析认为YJL是低致病力毒株，虽然选用高剂量，因与鸡源呼肠孤病毒基因序列同源性高达96%以上，可怀疑原宿主为鸡，由于宿主更替，致病能力因此改变，在番鸭宿主上呈现低致病状态，但毋庸置疑，YJL仍然具有一定的致病力。而YB-H与YB-L组之间，在细胞活力和趋势上只有少许差异，可见即便宿主被少量该高致病力毒株感染，也会造成高致病状态。

3 讨 论

番鸭呼肠孤病毒病给养殖业造成很大的经济损失，由于该病引起免疫器官淋巴细胞发生病理变化，进而导致免疫抑制。据此，早期进行预防是防治该病的关键。研究接种不同致病力MDRV之后各个时间点的MDEF活力，为致病机理的研究提供数据基础，对未来根据致病机理进行防治十分必要。

细胞凋亡是基因控制的、细胞的自然死亡，也是有多因素和多种通路参与的过程。检测时不能根据单一指标来判断细胞凋亡，一般需要同时检测三个以上指标，互相验证，以保证检测的准确性；而保证准确的前提则需要对凋亡事件选取不同的时间进行检测，与此同时，更要设置好高质量的阴性对照组，避免出现假阳性或者假阴性。

在本试验中，不同致病力MDRV毒株YB和YJL毒株对细胞凋亡的影响是显而易见的，通过各种定性和定量的方法互相验证出诱导凋亡的时间和水平。在对系列时间点MDEF活力和凋亡水平影响的检测中，MDEF活力在接毒后36 h达到最高，高致病力YB毒株使MDEF在48 h出现明显凋亡，低致病力YJL毒株使MDEF在72 h出现明显凋亡。在对番鸭组织器官（肝脏和脾脏）的细胞凋亡检测中，YB毒株对肝脏细胞的致凋亡作用尤为凸显。

在获得两毒株诱导细胞凋亡最佳时间和水平数据后，可以在后续试验中对细胞凋亡信号通路的研究提供借鉴。在该时间点上可检测相关蛋白的活性，如Caspase 9活性、Caspase 8活性、Bap31等，以确定不同致病力MDRV诱导细胞凋亡主要是内源线粒体通路、外源死亡受体通路还是内质网通路，然后再判断各通路具体的分子调控机制。如此，不同致病力MDRV毒株在致病机理上的异同便日渐显现，根据致病机理防治番鸭呼肠孤病毒病，将取得事半功倍的效果。

[1]林锋强,朱小丽,陈少莺,等.番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究[J].福建农业学报,2012,27(3)：217-221.

[2]胡奇林,陈少莺.番鸭呼肠孤病毒病(肝白点病)研究进展[J].福建畜牧兽医,2004,26(z1)：7-9.

[3]林锋强,朱小丽,陈少莺,等.番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律[J].福建农业学报,2011,26(3)：335-337.

[4]胡奇林,林锋强,陈少莺,等.应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒[J].中国兽医学报,2004,24(3)：231-232.

[5]杜伟伟.MTT检测肾疏宁含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用[J].中国中西医结合肾病杂志,2012,13(12)：1050-1052.

[6]张学敏,傅颖媛.MTS法在肿瘤药敏试验中的研究进展[J].江西医学检验,2005,23(3)：252,285.

The impact of the muscovy duck reovirus on the muscovy duck embryo fibroblast activity by MTS method

Lin Zexin
（Pinghe county animal disease prevention and control center,Pinghe Fujian 363700）

The experiment adopts the MTS method to detect the effects of different pathogenicity of muscovy duck reovirus on muscovy duck embryo fibroblast viability after inoculation of 12 h,24 h,36 h,48 h,72 h,96 h.according to cell lesions and dynamic state to determine the inflection point,characteristic changes of inducing apoptosis and cell viability after muscovy duck reovirus infection,further understand the relationship between virus and host,and provide scientific basis for the infection and pathogenesis of muscovy duck reovirus.Results show that after inoculated 36 h,cell activity reached the highest level,MDEF infected by the high pathogenic YB strain,the cell activity decreased significantly in 48 h and showed obvious cell apoptosis,MDEF infected by The low pathogenic YJL strain,the cell apoptosis was apparent in 72 h.

The MTS test Muscovy duck reovirus Muscovy ducks embryo fibroblasts The cell vitality

A

1003-4331（2017）06-0013-04