三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响

陈秀霞 郑在予 黄 河 池洪树 龚 晖

福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003

三七总皂甙对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关基因表达的影响

陈秀霞 郑在予 黄 河 池洪树 龚 晖＊

福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003

本试验将三七总皂甙（PNS）体外作用于大黄鱼肾细胞，通过活细胞计数和荧光定量PCR检测，初步了解PNS对大黄鱼肾细胞生长及部分免疫相关因子表达的影响。结果显示，40～200 μg/mL浓度的PNS对大黄鱼肾细胞生长无明显影响，但浓度达到1 mg/mL以上时，对细胞生长有负面影响；10～1 000 μg/mL浓度的 PNS对大黄鱼肾细胞Toll样受体5 mRNA的表达有一定的上调作用，但对Toll样受体3的表达有一定的下调作用；PNS浓度为10～100 μg/mL时对大黄鱼肾细胞碱性磷酸酶的表达无明显影响，但浓度达到1 000 μg/mL时对该因子的表达有下调作用；PNS浓度为10 μg/mL时对大黄鱼肾细胞溶菌酶的表达无明显影响，但浓度达到100 μg/mL以上时对该因子的表达具有一定的下调作用。

三七总皂甙 大黄鱼 肾细胞 Toll样受体 碱性磷酸酶 溶菌酶

三七总皂甙 （Panax notoginseng saponins，PNS）为植物三七提取的有效活性成分，其主要成分为人参皂甙R b1、人参皂甙R g1、三七皂甙R1等，具有广泛的药理作用，其中包括免疫调节作用[1-2]。目前研究较多的是PNS对哺乳动物的免疫调节作用，有关PNS对鱼类免疫调节作用的研究报道较少，尚未见PNS对鱼类体外细胞免疫相关因子表达影响的相关研究报道。本试验将PNS体外作用于大黄鱼肾细胞，通过活细胞计数和部分相关免疫因子表达量的检测，初步了解PNS对大黄鱼肾细胞的毒性及免疫因子表达的调节作用。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 试验所采用的第47代大黄鱼肾细胞系（YCK）由本实验室建系并保藏。

1.2 主要仪器 高速冷冻离心机（Sigma），紫外分光光度计 （Beckman）；CFX384多重实时荧光定量PCR 仪（Bio-Rad）；生化培养箱（上海博迅）。

1.3 主要试剂 三七总皂甙（PNS）购自南京泽朗医药科技有限公司，含量为95%。L-15细胞培养液为Hyclone公司产品，胎牛血清为Gibico公司产品，台盼蓝（Sigma 产品）以 0.01 M PBS（pH7.4）配制成 4%母液，4℃保存，使用时用 0.01 M PBS（pH7.4）稀释成0.4%工作液。RNA提取试剂盒为TRIzolⓇPlus RNA Purification Kit（Invitrogen公司产品）和RNase-Free DNase Set（Qiagen公司产品）；逆转录（RT-PCR）试剂盒为 SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR （Invitrogen公司产品）；Real time RT-PCR检测使用的试剂盒为Power SYBRⓇGreen PCR Master Mix（Applied Biosystems公司产品）。引物为上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PNS对细胞的毒性

1.4.1 YCK细胞24孔培养 将YCK细胞接种于24孔培养板，采用含10%胎牛血清的L-15培养液培养， 每孔 500 μL，细胞浓度为 1×105个/mL，于生化培养箱27℃培养24 h后，吸弃培养液，进行给药试验，给药孔处理如下：给药孔分别加入500 μL含不同浓度梯度的PNS，含10%胎牛血清的L-15培养液，得到 5 mg/mL、1 mg/mL、200 ug/mL、40 ug/mL、8 ug/mL、1.6 ug/mL、0.32 ug/mL 共 7个浓度组；正常空白对照孔加500 μL含10%胎牛血清的L-15培养液；各组设三个平行，于27℃生化培养箱继续培养24 h。

1.4.2 PNS对细胞的毒性试验 取出培养板，各孔上清液吸入对应编号试管中，细胞层用0.35%胰酶消化，用新生小牛血清2滴终止反应，每孔加L-15细胞培养液1 mL，收集细胞悬液于对应上清液试管中，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，留0.3～0.5 mL，轻轻吸吹为细胞悬液，取细胞悬液9滴移入尖底试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液混匀，用血球计数板计数拒染的活细胞数。

1.5 Real time RT-PCR检测部分细胞因子mRNA的表达

1.5.1 YCK细胞在细胞瓶中培养 将YCK细胞接种于50 mL的细胞培养瓶，每瓶加入含10%胎牛血清的L-15培养液10 mL，于生化培养箱27℃培养至细胞长成单层后，每瓶分别加入PNS，使终浓度分别为 10 μg/mL、100 μg/mL 和 1 000 μg/mL， 每个浓度均设三个平行，同时设未加PNS的对照组。于27℃生化培养箱继续培养24 h。

1.5.2 Real time RT-PCR模板制备 用细胞刮刀刮取细胞，重悬于5 mL无血清的L-15细胞培养液中，800 r/min离心5 min，吸弃上清液，用PBS洗涤沉淀后加1 mL Trizol，吹打裂解细胞5 min，移至EP管。总RNA提取步骤参照试剂盒说明书操作。按照逆转录反应试剂盒操作说明配制反应体系，反应条件为 25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min，贮存在-20℃备用。

1.5.3 Real time RT-PCR引物合成 细胞因子Toll样受体 3（TLR3）、Toll样受体 5（TLR5）、碱性磷酸酶（ALP）和溶菌酶（LZM）的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.4 Real time RT-PCR 按照试剂盒说明配制PCR反应体系，反应条件：95℃，1 min；40个循环（95 ℃，15 s；63 ℃，25 s，收集荧光）。 熔点曲线包括95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。 为校正组间加样误差，以内参β-Actin的CT值对样本拷贝数加以校正，利用2-ΔΔCT方法计算出待测基因的相对表达量，其中CT是PCR产物荧光达到检测阈值的扩增循环数。每个样本设3个重复孔。

2 结果与分析

2.1 三七总皂甙对细胞的毒性 图1示大黄鱼肾细胞在不同浓度PNS作用下的生长情况。随PNS浓度的变化（0.32 μg/mL～5 mg/mL），大黄鱼 YCK 活细胞数呈正态分布。当PNS的浓度达到1 mg/mL以上时，对细胞生长有负面影响。

图1 大黄鱼肾细胞在不同浓度三七总皂甙作用下的生长情况

图2 大黄鱼肾细胞部分因子在三七总皂甙作用下的相对表达量

2.2 三七总皂甙对大黄鱼肾细胞部分细胞因子表达的影响 图2 （a、b、c、d） 示大黄鱼肾细胞因子TLR3、TLR5、ALP和 LZM 在不同浓度 PNS作用下的相对表达量。

从图 2（a）中可见，10 μg/mL 的 PNS 对 TLR3 的表达无明显影响，但100 μg/mL和1 000 μg/mL的PNS对TLR3的表达具有下调作用，且下调作用与皂甙浓度呈正相关。

从图2（b）中可以看出，各浓度皂甙组TLR5的表达量均高于对照组，且随PNS浓度加大，TLR5的表达量越高。当PNS浓度为1 000 μg/mL时，TLR5的表达量是对照组的2.5倍。这表明PNS对大黄鱼肾细胞因子TLR5的表达具有上调作用。

从图 2（c）可以看出，10 μg/mL 和 100 μg/mL 皂甙组ALP的表达量与对照组无明显差别；当皂甙浓度提高到1 000 μg/mL时，ALP的表达量低于对照组。这表明低浓度PNS对ALP的表达无明显影响，高浓度PNS对ALP的表达具有下调作用。

从图 2（d）可以看出，10 μg/mL 皂甙组 LZM 的表达量与对照组无明显差别；当皂甙浓度为100 μg/mL 和 1 000 μg/mL 时，LZM 的表达量明显低于对照组。这表明一定浓度的PNS对LZM的表达具有下调作用。

3 讨 论

PNS对YCK细胞毒性试验的初步结果显示，YCK细胞的活细胞数与PNS浓度之间的关系并非呈线性关系，而是呈正态分布。PNS具有促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化的作用[3]。本研究也表明，当PNS浓度为200 μg/mL时，对YCK细胞具有一定的促进增殖作用，但随着PNS浓度升高，YCK活细胞数明显下降，说明高浓度的PNS对YCK细胞增殖具有抑制作用。

Toll样受体是一类Ⅰ型跨膜糖蛋白模式识别受体，其通过识别病原体，激活天然免疫，可诱导产生多种细胞因子，在抗感染免疫中发挥重要作用[4]。迄今在鱼类中已发现多种Toll样受体。Toll样受体3同时存在于哺乳动物和鱼类，位于细胞质核内体上，参与双链RNA的识别，是抗病毒免疫反应和免疫机制进化研究的理想对象[5]。Toll样受体5是机体免疫系统识别鞭毛蛋白的受体，介导机体针对鞭毛蛋白产生的免疫反应和炎症反应[6]。本试验初步结果表明，PNS对YCK细胞TLR3的表达有一定的下调作用，而在PNS作用下，TLR5的表达上调，是否意味着TLR5是PNS的主要受体？其机理还有待进一步研究探讨。

碱性磷酸酶在鱼体内是一种参与代谢调控的非特异性磷酸水解酶，参与钙磷代谢，与机体的免疫密切相关[7]。溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用[8]。本试验结果显示，低剂量的PNS对大黄鱼肾细胞的碱性磷酸酶和溶菌酶的表达没有明显影响，但当PNS的浓度达到1 mg/mL时，对这两种酶的表达有一定的下调作用。据报道，饲料中添加适量的PNS可显著提高罗非鱼血清溶菌酶和碱性磷酸酶的活性[9]，该报道结果与本研究的试验结果不一致，这可能与二者的试验对象、方法、采样部位及PNS剂量不同有关。目前尚未见其他有关PNS对鱼类体外细胞溶菌酶和碱性磷酸酶mRNA表达影响的研究报道。

4 结 论

高浓度的PNS对大黄鱼肾细胞的生长有负面影响。PNS对大黄鱼肾细胞的Toll样受体TLR3的mRNA的表达有一定的抑制作用，但对Toll样受体TLR5的表达有一定的促进作用。低浓度的PNS对大黄鱼肾细胞碱性磷酸酶和溶菌酶的表达无明显影响，但高浓度的PNS对该因子的表达具有一定的抑制作用。

[1]刘剑娜,朱靖博,闰海全,等.三七总皂苷中Rg1和Rbl的分离纯化[J].大连工业大学学报,2010,29(1)：18-20.

[2]张喜平,齐丽丽,刘达人.三七及其有效成分的药理作用研究现状[J].医学研究杂志,2007,36(4)：96-98.

[3]刘东宁,王云国,刘志礼,等.三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2表达及碱性磷酸酶活性的影响[J].南昌大学学报（医学版）,2012,52(9)：9-13.

[4]吴迪,刘玉芬,唐敬洁.Toll样受体及其与细菌感染性疾病关系的研究进展[J].中国家禽,2016,38(17)：50-52.

[5]ROACH J C,GLUSMAN G,ROWEN L,et al.The evolution of vertebrate Toll-like receptors[J].Proc Nati Acad Sci USA,2005,102(27)：9577-9582.

[6]杨昱,徐剑铖,钱桂生,等.Toll样受体5在鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤中的表达及其研究 [J].中华肺部疾病杂志,2007,1(1)：52-55.

[7]罗克.动物粘膜免疫系统研究进展 [J].福建畜牧兽医,2000,22(5)：44-49.

[8]王建超,张培军,张东鸣,等.不用组合芽孢杆菌对鲤鱼免疫功能的影响[J].中国兽医杂志,2016,52(2)：110-113.

[9]杨志刚,忻晨,阙有清,等.三七总皂苷对罗非鱼体成分及非特异免疫的影响[J].饲料工业,2010,31(14)：10-12.

The effects of Panax notoginseng saponins on the growth and the immune related genes expression of large yellow croaker kidney cells

Chen Xiuxia Zheng Zaiyu Huang He Chi Hongshu Gong Hui*
(Biotechnology Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences Fuzhou 350003)

In this study,large yellow croaker kidney cells （YCK)were exposed to Panax notoginseng saponins （PNS)in vitro.To evaluate the effect of PNS on the growth and the immune related genes expression of YCK,living cells count and real time RT-PCR were performed.The results showed that PNS with the concentration of 40～200 μg/mL had no obvious effect on the growth of YCK,but when the concentration reached 1 mg/mL,it had a negative effect on cell growth.PNS with the concentration of 10～1 000 μg/mL upregulated the expression of the toll-like receptor 5 mRNA of YCK,but it down-regulated the expression of the toll-like receptor 3.PNS with the concentration of 10～100 μg/mL had no influence on the expression of alkaline phosphatase of YCK,but the expression of the factor was down-regulated when the concentration of PNS reached 1 000 μg/mL.PNS with the concentration of 10 μg/mL had no obvious influence on the expression of lysozyme in YCK,but it reduced the expression of this factor when the concentration reached 100 μg/mL.

Panax notoginseng saponins （PNS)Large yellow croaker（Pseudosciaena crocea)Kidney cells Toll-like receptor Alkaline phosphatase Lysozyme

A

1003-4331（2017）06-0007-04

福建省自然科学基金（2015J01106）、大黄鱼育种国家重点实验室开放课题基金资助。

陈秀霞 （1977-）， 副研究员。E-mail：xiuxiachen@163.com。

＊ 通信作者：龚晖（1971-），研究员。 E-mail：ghxfjm@163.com。