应用荧光PCR诊断鸡腺胃型传染性支气管炎

陈秀琴 黄梅清 蔡 羲 江 斌 陈少莺 吴南洋＊

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

应用荧光PCR诊断鸡腺胃型传染性支气管炎

陈秀琴1,2黄梅清1,2蔡 羲1,2江 斌1,2陈少莺1,2吴南洋1,2＊

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013）

应用荧光PCR试剂盒对临床表现为消瘦和腺胃肿大为特征的患鸡病料进行鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）核酸检测。结果显示：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测为阳性，禽网状内皮组织增殖病病毒荧光RT-PCR检测为阴性，鸡马立克氏病病毒荧光PCR检测为阴性。结合患鸡精神沉郁，极度消瘦，腺胃肿大如球状等的临床表现，综合分析表明该患鸡发病主要病因为感染鸡腺胃型传染性支气管炎病毒。

传染性支气管炎 腺胃型 病原检测

鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒 （IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病[1]。IBV非常容易通过突变和重组而产生新的血清型[2]。目前，至少已经分离出二十多个血清型和变异株，主要包括呼吸道型、肾型、肠型和腺胃型等，我国主要以肾型传染性支气管炎为主[3-4]。1997年，王玉东首次报道引起腺胃病变的IBV变异株，并将其暂命名为腺胃型传染性支气管炎[5]。腺胃型传染性支气管炎已在全国范围内传播，江苏、山东、安徽、河南、河北等省区均有该病的报道。福建省农业科学院畜禽水产疫病诊疗中心每年接诊的家禽疾病中，确诊为腺胃型传染性支气管炎的病例可达十多例。该病在临床症状和病理变化与禽网状内皮组织增殖病和腺胃型马立克氏病非常相似，需要进行实验室检测才能确诊。感染该病的鸡群病死率较高，可达30%～50%[6]，给养殖场带来严重的经济损失。本项目组对福建省某养鸡场送检的病死鸡进行病理观察和实验室病原检测，结合临床表现和流行病学情况，初步表明该病例是由腺胃型传染性支气管炎病毒引起的，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；鸡传染性支气管炎病毒荧光RTPCR检测试剂盒购自北京生科尚仪科技有限公司；禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）和鸡马立克氏病病毒（MDV）核酸扩增检测试剂盒（PCR荧光探针法）购自广州维伯鑫生物科技有限公司。

1.2 临床症状与病理观察 观察患鸡的精神状态、羽毛、粪便及呼吸情况，检查患鸡的营养状况、皮肤和爪。患鸡解剖后检查五脏、肠、气囊、气管和法氏囊是否发生病理变化。

1.3 病料处理 无菌采集病死鸡肿大的腺胃、肺、肝等组织，按1∶5的比例加入无菌PBS匀浆后制成乳悬液，反复冻融3次，8 000 r/min离心15 min后收集上清液。

1.4 病原的荧光PCR检测

1.4.1 核酸提取 吸取上清液200 μL到1.5 mLR-Nase-free的离心管，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书提取样品的核酸。核酸提取步骤按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书操作。

1.4.2 IBV荧光RT-PCR反应体系及条件 反应体系：RT-PCR 反应液 15 μL，RT-PCR 酶 0.25 μL，Taq酶0.25 μL，RNA溶液 10 μL。 扩增分 4步进行。 第1步：42℃ 30 min；第2步：92℃ 3 min；第3步：92 ℃ 10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s （5个循环）；第4步：92℃ 10 s，60℃ 30 s(40个循环)， 收集FAM荧光。

1.4.3 REV荧光RT-PCR反应体系及条件 反应体系：反应液 20 μL，酶液 1 μL，RNA 溶液 4 μL。 扩增分3步进行。第1步：42℃ 20 min；第2步：95℃10 min；第 3 步：94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s（40 个循环），收集FAM荧光。

1.4.4 MDV荧光PCR反应体系及条件 反应体系：反应液 20 μL，酶液 1 μL，DNA 溶液 4 μL。 扩增分2步进行。第1步：95℃ 10 min；第2步：94℃15 s，55 ℃ 30 s（40 个循环），收集 FAM 荧光。

2 结果与分析

2.1 临床症状与病理变化 患鸡精神沉郁，呼吸有啰音，羽毛松乱，脚干脱水，体型极其消瘦（见图1），发育不良，排黄色、白色稀粪，或水样腹泻，泄殖腔口附近的羽毛有粪便粘住。

剖检患鸡可见气管环出血，气囊浑浊，腺胃极度肿胀，肿大如球状（见图2），腺胃壁增厚，肌胃瘪缩，其他器官无明显眼观可见病理变化。

图1 患鸡极度消瘦

2.2 病原的荧光PCR检测 应用IBV荧光RTPCR检测试剂盒检测IBV，扩增曲线见图3。阳性对照、阴性对照和样品的CT值分别为21.3、none、14.0，因此，判定样品为IBV阳性。

应用REV荧光RT-PCR检测试剂盒检测REV，扩增曲线见图4。阳性对照、阴性对照和样品的 CT值分别为 19.5、none、none，因此，判定样品为REV阴性。

图2 患鸡腺胃肿大如球状

应用MDV荧光PCR检测试剂盒检测MDV，扩增曲线见图5。阳性对照、阴性对照和样品的CT值分别为24.6、39.5、none，因此，判定样品为MDV 阴性。

图3 IBV荧光RT-PCR扩增曲线

图4 REV荧光RT-PCR扩增曲线

3 结论与讨论

应用荧光PCR试剂盒对病死鸡进行IBV、REV和MDV病原检测，检测结果为IBV阳性，REV和MDV均为阴性，结合临床症状和病理剖检变化，初步诊断该起病例为腺胃型传染性支气管炎。

图5 MDV荧光PCR扩增曲线

IB不仅直接影响鸡的生产性能，还会导致免疫机能下降，继发感染其他疾病，发病率和病死率都很高，已被世界卫生组织列为B类疫病。该病无明显的发病季节，各年龄和品种的鸡都易感，雏鸡发病率可达75%～90%[7]。IB主要是通过空气和排泄物接触传播，病程为15~35 d，甚至可长达2个月[8]。目前，IBV已经有呼吸道型、肾型、肠型和腺胃型等多种血清型，不同血清型之间不存在交叉反应或交叉反应很小[4]。近十年来，鸡传染性支气管炎病毒LX4型QX分离株的比例不断增加，而常用疫苗株M41基因型分离株的比例却不断减少[9]，因此，现有的疫苗对鸡传染性支气管炎的保护效果不好。许多研究者也开始研发新型疫苗，如重组载体DNA疫苗、质粒DNA疫苗等[10]。目前还没有治疗IB的特效药，临床上一般使用抗病毒中药来缓解症状，无治疗价值的鸡一般予以淘汰。预防控制IB的主要措施是疫苗接种，进行免疫监测，加强平时的饲养管理等。

[1]Cook J K A,Orbell S J,Woods M A.A survey of the presence of a new infectious bronchitis virus designated 4/91(793B)[J].The Veterinary record,1996,138(8)：178-180.

[2]Lee C W,Jackwood M W.Evidence of genetic diversity generated by recombination among avian coronavirus IBV[J].Archives of Virology,2000,145(10)：2135-2148.

[3] Yu L,Jiang Y,Low S,etal.Characterization ofthree infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens[J].Avian Diseases,2001,45(2)：416-424.

[4]刘胜旺.我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析[J].中国家禽,2010,32(16)：5-9.

[5]王玉东,张子春,王永玲,等.鸡腺胃型传染性支气管炎研究初报[J].中国动物检疫,1997,14(3)：6-8.

[6]张淑霞,杨增岐,贺秀媛,等.鸡腺胃型传染性支气管炎病毒的分离与初步鉴定[J].动物医学进展,2006,27(12)：79-81.

[7]闫艺婷,勾肖晶,刘静,等.传染性支气管炎病毒的分子生物学特性及其弱毒疫苗的研究进展 [J].中国畜牧兽医,2015,42(6)：1587-1591.

[8]宋臣峰鸡腺胃型传染性支气管炎的诊断及其病毒M基因序列分析[D].保定：河北农业大学,2011.

[9]张国中,赵烨,程晋龙,等.1994-2014年禽传染性支气管炎病毒流行演化趋势分析 [C]//第四届全国禽病分子生物技术青年工作者会议论文集.天津,2015.

[10] BandeF,Arshad S S,Bejo M H,etal.Progressand challenges toward the development of vaccines against avian infectious bronchitis.[J].Journal of Immunology Research,2015(424860)：1-12.

Diagnosis proventriculus type infections bronchitis by applying real-time fluorescent quantitative PCR

Chen Xiuqin1,2Huang Meiqing1,2Cai Xi1,2Jiang Bin1,2Chen Shaoying1,2Wu Nanyang1,2*
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350013；2.Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center,Fuzhou 350013)

The study detected the nucleic acid of diseased chickens with clinical symptoms of emaciation and swollen proventriculus by using fluorescent PCR kit.The detection including infections bronchitis virus(IBV),Reticuloendotheliosis virus(REV)and Marek's Disease(MDV).The results showed that IBV was positive but REV and MDV were negative.Combing the clinical symptoms of acting depressed,extreme emaciation and swollen proventriculus,thus,it was concluded that the diseased chickens were infected with IBV.

Infections bronchitis Proventriculus type Pathogen detection

A

1003-4331（2017）06-0010-03

福建省现代农业鸡产业技术体系（2013-2017年）资助。

陈秀琴（1988-），女，硕士。研究方向：预防兽医学。E-mail：lyunxqchen@163.com。 并列第一作者：黄梅清(1980-)，女，硕士，助理研究员。研究方向：预防兽医学。

＊通信作者：吴南洋（1963-），男，高级兽医师。主要从事兽医临床和健康养殖技术研究。E-mail：wunanyang@vip.sina.com。