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8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量比较与相关性分析

2017-12-19丁瑜潇吕伟旗沈宏伟丽水市人民医院药剂科浙江丽水323000

中国药房 2017年34期
关键词:石竹经纬度甲酯

丁瑜潇,吕伟旗,沈宏伟(丽水市人民医院药剂科,浙江丽水323000)

8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量比较与相关性分析

丁瑜潇*,吕伟旗,沈宏伟#(丽水市人民医院药剂科,浙江丽水323000)

目的:为木鳖子良种选育与高产优质栽培提供参考。方法:在2015年版《中国药典》(一部)等文献基础上,优化测定木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量的高效液相色谱(HPLC)法;比较8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量并进行聚类分析;采用SPSS 17.0软件分析海拔、经纬度与木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量间的相关性。结果:木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯质量浓度在0.05~0.5 mg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系,回归方程为Y=4 361.95X+67.380 8(R2=0.999 7);定量限为15.62 ng,检测限为4.67 ng;平均回收率为99.76%(RSD=1.36%,n=9)。8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量存在极显著差异(P<0.01)。根据聚类分析结果,将8个省14个产地的木鳖子划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个类群,Ⅲ与Ⅳ类群木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量较高,包括广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、福建省建阳区与湖南省会同县5个产地,其中广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、湖南省会同县属于高海拔、低经纬度地区,福建省建阳区属于高海拔地区。木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量与海拔呈正相关,与经度、纬度呈负相关。结论:测定木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量的HPLC法简便、准确、重复性好,所测8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量均达到2015年版《中国药典》(一部)标准,广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、湖南省会同县等低经纬度、高海拔地区栽培有利于积累木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯成分。

木鳖子;丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯;产地;相关性

木鳖子系葫芦科多年生蔓性植物木鳖[Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.]的干燥成熟种子,别名漏苓子、藤桐子、木蟹等。木鳖子去壳取仁入药,性凉,味苦、微甘,有毒,归肝、脾胃经,具有散结消肿、攻毒疗疮等功效,临床用于治疗疮疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔瘘、秃疮等症[1-2]。药理学研究表明,木鳖子具有抗肿瘤、降压、抗氧化、抗炎镇痛、抗病毒、抗菌杀螨等作用[3-9]。木鳖子主要分布在浙江、安徽、湖南、广西壮族自治区、江苏、江西、贵州等地区,因栽培地生态环境各异,不同产地木鳖子在物候期、生态适应性、农艺性状、有效成分含量积累等方面存在差异。丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯是2015年版《中国药典》(一部)规定的木鳖子主要活性成分。据此,笔者收集了全国主要产区8个省14个产地的木鳖子样品,采用高效液相色谱(HPLC)法对木鳖子样品中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯的含量进行测定,并分析海拔、经纬度与丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量间的相关性,以期为木鳖子良种选育与高产优质栽培提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Milli-Q Academic超纯水仪(美国Millipore公司);DK-S24型电热恒温水浴锅、DGG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);GT10-2型高速离心机(北京时代北利离心机有限公司);RE-5000B型旋转蒸发仪(上海一科仪器有限公司);SHB-Ⅲ型台式循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);FW100型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);S210型台式pH计、MS型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 药材、药品与试剂

2016年2-4月采集浙江、安徽、福建、广西壮族自治区、贵州、江苏、江西、湖南等地野生木鳖子药材14批,每批10份,每份15株,经丽水市人民医院沈宏伟主任药师鉴定为葫芦科植物木鳖[Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.]的干燥种子,详见表1。丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯标准品(上海源叶生物科技有限公司,批号:2016B21199,纯度:≥99.5%);乙腈(色谱级,国药集团化学试剂有限公司,批号:201540064184);石油醚、甲醇、氯仿、浓硫酸等试剂均为分析纯,水为蒸馏水。

表1 8个省14个产地木鳖子药材采集信息Tab 1Information of M.cochinchinensis medicinal material from 14 production places of 8 provinces

2 方法

2.1 丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量测定方法

按文献[1]方法测定含量。

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取100℃干燥至恒质量的丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯标准品50 mg,置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即为对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备将烘干至恒质量的木鳖子,去壳取仁,粉碎过60目筛。精密称取药材粉末1 g,加石油醚-氯仿溶液(V∶V=1∶1)50 mL,75℃索氏提取110 min,弃石油醚-氯仿溶液,滤纸筒挥尽溶剂后置于圆底烧瓶中,加60%甲醇100 mL,80℃加热回流3 h。旋转蒸干溶剂,加水10 mL溶解残渣,加浓硫酸0.6 mL,密闭封口,沸水浴2 h,冷却至室温,弃滤液。用适量甲醇溶解残渣至10 mL棕色量瓶中,用硫酸调节pH至2.0,摇匀,50℃水浴中放置3 h,冷却至室温,甲醇定容至刻度,摇匀滤过,取续滤液,即得。

2.1.3 色谱条件色谱柱:Agilent Eclipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,4.6 μm);流动相:乙腈(A)-0.3%乙酸水(B),梯度洗脱(0~5 min,95%A~83%A;5~15 min,83%A~80%A;15~25 min,80%A~70%A;25~65 min,70%A);流速:1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30℃;进样量:25 μL。

2.1.4 线性关系及定量限考察将标准品溶液稀释为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的系列标准溶液,过0.45 μm有机微孔滤膜,按“2.1.3”项下色谱条件测定。以峰面积(y)为纵坐标、标准溶液质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线,得线性方程为y=4 361.95x+67.380 8(R2=0.999 7),线性范围为0.05~0.5 mg/mL。取标准品溶液适量,等倍逐步稀释,按“2.1.3”项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。结果,当信噪比为10∶1时,定量限为15.62 ng;当信噪比为3∶1时,检测限为4.67 ng。

2.1.5 稳定性考察取M7样品,按“2.1.2”项下方法制备样品溶液后,放入适宜的开口容器中,置于以下条件保存:①高温度条件(40℃,避光);②高湿度条件[室温,相对湿度为(90±5)%,避光];③强光照射条件[室温,在(4 500±500)lx光照强度下照射][10]。分别于保存0、2、4、6、8、10、12、24 h时进样,按“2.1.3”项下色谱条件测定峰面积,计算得各处理条件下丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯峰面积的RSD值。结果,高温度、高湿度、强光照射试验RSD分别为0.26%、0.67%、18.96%(n=8),表明样品溶液在强光照射下不稳定,在高温、高湿、避光条件下保存24 h内稳定。

2.1.6 重复性考察取M7样品6份,按“2.1.2”项下方法制备样品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件测定,计算得丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯平均含量为0.306 5%,RSD为1.21%(n=6),表明试验重复性良好。

2.1.7 精密度考察取同一标准品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次,计算得丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯峰面积RSD为0.66%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.1.8 加样回收率试验取已知丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量的M7样品,分别加入标准品适量,按“2.1.2”项下方法制备样品溶液(配制成低、中、高3种浓度梯度),按“2.1.3”项下色谱条件测定,计算加样回收率(%)=(C-A)/B×100%。式中,A为样品中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量,B为加入标准品含量,C为实际测得量]。结果,低、中、高3种浓度的平均加样回收率分别为100.23%、99.90%、99.15%,RSD分别为0.85%、1.43%、1.94%(n=9)。

2.2 数据分析与处理

采用SPSS 17.0与DPS 9.05软件进行数据处理。组间均数比较采用单因素方差分析;聚类分析采用类平均法;相关性分析采用Bivariate法。

图1 高效液相色谱图Fig 1HPLC chromatograms

3 结果与分析

3.1 HPLC法测定木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量的方法优化

(1)波长选择:对木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯色谱峰进行全吸收光谱扫描时发现,在203 nm波长处有最大吸收峰,与2015年版《中国药典》(一部)木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量测定波长一致,故选择203 nm作为检测波长。(2)提取方法:根据2015年版《中国药典》(一部)与文献[11-13],对木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯提取工艺进行了优化。在索氏提取弃去石油醚-氯仿提取液后,分别考察加热回流提取时间为2、3、4、5 h,提取温度为60、70、80、90℃,甲醇体积分数为50%、60%、70%、80%时对提取的影响。结果表明,木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯在60%甲醇中以80℃加热回流提取3 h即可提取完全,操作简便,总提取时间较2015年版《中国药典》(一部)减少2.17 h。(3)流动相选择:比较0.1%乙酸水、0.3%乙酸水、0.4%磷酸水与乙腈流动相比例时发现,以乙腈-0.3%乙酸水为流动相,按“2.1.3”项下梯度洗脱条件进行洗脱,丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯出峰时间早、峰形好,分离度大于1.5,理论板数大于3 000,保留时间为24.12 min。高效液相色谱图见图1。

3.2 不同产地木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量比较与聚类分析

8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量存在极显著差异(P<0.01),平均含量为0.330 0%,均达到2015年版《中国药典》(一部)不低于0.25%的标准。湖南、贵州、广西产木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量相对较高,其中湖南省会同县产木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量最高,达0.421 5%;其次为浙江、江苏、福建、江西;安徽产木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量较低,其中安徽省祁门县木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量仅为0.251 0%,详见表2。

表2 8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量比较(±s,n=3,%%)Tab2Comparisonofthecontentsofgypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces(±s,n=3,%%)

表2 8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量比较(±s,n=3,%%)Tab2Comparisonofthecontentsofgypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces(±s,n=3,%%)

注:不同字母表示在P<0.01水平存在极显著差异Note:Different letters indicated significant differences at P<0.01

丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量0.387 7±0.028 6B 0.421 5±0.030 9A 0.368 2±0.037 5C 0.395 2±0.038 2B 0.372 1±0.067 3C 0.298 7±0.032 1FG 0.337 1±0.042 1D编号产地编号产地M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7浙江省昌化镇浙江省湍口镇浙江省常山县江苏省宜兴市安徽省祁门县安徽省黟县广西壮族自治区钟山县丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量0.283 1±0.021 4H 0.290 1±0.013 9GH 0.321 6±0.018 4E 0.321 5±0.019 5E 0.251 0±0.024 7J 0.265 1±0.017 1I 0.306 5±0.056 5F M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14广西壮族自治区平南县湖南省会同县贵州省德江县贵州省江口县福建省建阳区福建省浦城县江西省广丰区

以丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量为指标对8个省14个产地的木鳖子进行聚类分析,根据欧式距离D2=0.041的聚类水平,将供试木鳖子划分为4个类群,见图2。类群Ⅰ共7个产地,包括浙江省昌化镇、浙江省湍口镇、广西壮族自治区钟山县、福建省浦城县、浙江省常山县、江苏省宜兴市、江西省广丰区,该类群丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯平均含量适中,为0.308 4%;类群Ⅱ共2个产地,均为安徽产地,丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯平均含量较低,仅为0.258 1%;类群Ⅲ与类群Ⅳ共5个产地,包括广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、福建省建阳区、湖南省会同县,此2类群丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量高,为0.388 9%。

图28 个省14个产地木鳖子药材聚类分析图Fig 2Cluster analysis diagram of M.cochinchinensismedicinalmaterialfrom14 production places of 8 provinces

3.3 海拔、经纬度与丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量的相关性分析

8个省14个产地木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量与海拔、经纬度间存在一定的相关性;海拔与木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量呈正相关,相关系数为0.413 66;经度、纬度与木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量均呈负相关,其中经度相关系数为0.698 90,纬度相关系数为0.541 88,见表3。根据文献[14-15]、8个省14个产地木鳖子平均海拔与经纬度分布,将海拔>450 m的地区定义为相对高海拔地区。结果,广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、福建省建阳区、湖南省会同县、安徽省黟县为相对高海拔地区,广西壮族自治区钟山县、广西壮族自治区平南县、湖南省会同县、贵州省德江县、贵州省江口县为相对低经纬度地区。相关性分析结果显示,高海拔、低经纬度地区栽培木鳖子有利于丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯成分的积累。

表3 木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量相关性分析结果Tab3Correlation analysisresultsofgypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis

4 讨论

目前市场上木鳖子药材主要依靠采挖野生资源,人工栽培面积少,故收集并评价不同产地木鳖子有效成分含量对木鳖子良种选育与高产栽培具有重要意义[16]。中药材的有效化学成分与生态因子存在相关性,海拔、经纬度等生态因子可显著影响中药材有效成分积累[17-19]。本试验结果表明,我国主要分布区木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量均符合2015年版《中国药典》(一部)不低于0.25%的标准;8个省14个产地的木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量存在极显著差异(P<0.01),其中湖南、贵州、广西产木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量较高,可作为木鳖子优良种质筛选与品种选育的备选种质;木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量与海拔呈正相关,与经纬度呈负相关,高海拔、低经纬度栽培条件有利于木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯成分积累。聚类分析结果显示,8个省14个产地的木鳖子可划分为4个类群,其中类群Ⅲ与类群Ⅳ木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量较高,此2类群中广西壮族自治区平南县、贵州省江口县、贵州省德江县、湖南省会同县属于高海拔、低经纬度地区,福建省建阳区属于高海拔地区。

中药材实际栽培应综合考虑有效成分含量、药材产量、种质生态适应性差异、立地条件优劣等多方面因素。从8个省14个产地的木鳖子种质资源来看,高海拔地区温差大,木鳖子开花晚,种子生长期相对较长,这可能是促进木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯成分积累的因素之一。根据文献[9,20],结合本试验结果可知,浙江、江苏、江西、安徽、福建、贵州、广西、湖南等地木鳖子生态适应性较好,丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量满足2015年版《中国药典》(一部)要求。因此可知,在大田栽培木鳖子时,选择高海拔、低经纬度地区栽培有利于提高木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡糖醛酸甲酯含量。

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Content Comparison and Correlation Analysis of Gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic Acid Methyl Ester in Momordica cochinchinensis from 14 Production Places of 8 Provinces

DING Yuxiao,LYU Weiqi,SHEN Hongwei(Dept.of Pharmacy,Lishui People’s Hospital,Zhejiang Lishui 323000,China)

OBJECTIVE:To provide reference for variety breeding,high yield and high quality cultivation of Momordica cochinchinensis.METHODS:Based on Chinese Pharmacopoeia(2015 edition,VolⅠ),HPLC for determining the content of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis was optimized,the contents of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces were compared,and cluster analysis was conducted.Correlation of longitude,latitude and altitude with content of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis was analyzed by SPSS17.0 software.RESULTS:Gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis showed good linear relationship in 0.05-0.5 mg/mL,regression equation was Y=4 361.95X+67.380 8(R2=0.999 7);the limits of quantification and detection were 15.62 ng and 4.67 ng,respectively.Average recovery was 99.76%(RSD=1.36%,n=9).The content of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces had extremely significant differences(P<0.01).Clustering analysis results indicated that M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces were divided intoⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳgroups.Contents of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis ofⅢ,Ⅳgroups were relatively high,including Guangxi Pingnan,Guizhou Jiangkou,Guizhou Dejiang,Fujian Jianyang and Hunan Huitong,in which,Guangxi Pingnan,Guizhou Jiangkou,Guizhou Dejiang and Hunan Huitong had high altitude and low latitude,Fujian Jianyang had high altitude.The content of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis was positively correlated with altitude,while negatively correlated with longitude and latitude.CONCLUSIONS:HPLC is simple,accurate and reproducible for determining the content of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis,and the determined contents of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis from 14 production places of 8 provinces have reached the standard of Chinese Pharmacopoeia(2015 edition,VolⅠ).Cultivation in Guangxi Pingnan,Guizhou Jiangkou,Guizhou Dejiang,Hunan Huitong and other areas with high altitude and low latitude helps to improve the content accumulation of gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in M.cochinchinensis.

Momordica cochinchinensis;Gypsogenin 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester;Production place;Correlation

R914.1;R931.6

A

1001-0408(2017)34-4821-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.18

*药师。研究方向:中药材质量分析与检测。电话:0578-2292513。E-mail:cathy9393@163.com

#通信作者:主任药师。研究方向:中药成分分析。电话:0578-2292718。E-mail:lstracy1027@163.com

2017-02-26

2017-07-29)

(编辑:余庆华)

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