10批不同产地六棱菊中咖啡酸的工艺优化与含量测定Δ

魏江存，陈勇，谢臻，李耀华，唐春丽，阙祖亮，庾延和，张昕，庞丹清（.广西中医药大学药学院，南宁53000；.广西中医药大学第一附属医院药学部，南宁5300）

10批不同产地六棱菊中咖啡酸的工艺优化与含量测定Δ

魏江存1＊，陈勇1#，谢臻1，李耀华1，唐春丽2，阙祖亮1，庾延和1，张昕1，庞丹清1（1.广西中医药大学药学院，南宁530020；2.广西中医药大学第一附属医院药学部，南宁530022）

目的：优化六棱菊中咖啡酸提取工艺，并建立其含量测定方法。方法：以回流提取法提取六棱菊中咖啡酸。以提取含量为考察指标，设计正交试验，考察乙醇体积分数、料液比及提取时间对咖啡酸提取的影响，优化提取工艺条件。采用高效液相色谱法，以咖啡酸为对照品，在320 nm波长下测定10批不同产地六棱菊药材中的咖啡酸含量。结果：优化的提取工艺条件为乙醇体积分数为10%、料液比为1∶40、提取时间为3 h。以此条件对咖啡酸进行工艺验证试验，六棱菊中咖啡酸平均含量为0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）。10批不同产地六棱菊药材中咖啡酸含量在0.375 2～0.776 6 mg/g之间，含量差异较大。结论：六棱菊药材中咖啡酸含量与产地和采收季节等有关。本试验优选工艺提取咖啡酸重复性较好；建立的咖啡酸含量测定方法稳定、可行。

六棱菊；含量测定；咖啡酸；高效液相色谱法

六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]系菊科六棱菊属植物，全草入药，性苦、辛，微温，有祛风、除湿、解毒之功效，在民间作为抗菌消炎、清热解毒的良药，主要分布于我国东部、东南部至西南部，北至安徽和湖北[1]。因六棱菊新鲜的枝叶揉搓后散发特殊的臭味，民间称之为“臭灵丹”[2]，以“臭灵丹”为主的许多复方制剂在临床上应用也取得较好的疗效[3-5]。目前，六棱菊多应用于急性扁桃体炎[6]、感冒[7]、病毒感染[8]等的治疗。

六棱菊主要含倍半萜类、黄酮类、酚酸类等化学成分[2，9-12]，具有治疗急慢性炎症、抗肿瘤、抗病毒和抗微生物活性等功效[2]。其中，咖啡酸属于酚酸类化合物，在金银花、野菊花和蒲公英等植物中广泛分布。咖啡酸具有多种药理作用[13]，主要包括保护心血管、调节免疫、降脂、降糖、利胆止血等。以咖啡酸作为指标性成分进行含量测定，可以为六棱菊药材的质量标准奠定基础，然而国内外未见对其进行含量测定的相关报道。本试验不仅建立了六棱菊中咖啡酸的含量测定方法，还同时测定了广西壮族自治区内10批不同产地六棱菊中咖啡酸的含量，并比较不同产地药材中咖啡酸含量差异，为六棱菊药材的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695高效液相色谱仪，包括2489紫外检测器、四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3工作站（美国Waters公司）；Simplicity纯水系统（密理博中国有限公司）；Practum224-1CN分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱、HWS-26电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；0.45 μm微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 试剂与药材

咖啡酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1110885-200102，纯度：＞98.0%）；乙腈为色谱纯，甲醇和磷酸为分析纯，试验用水为纯水。所有六棱菊药材样品均经广西中医药大学药学院田辉教授鉴定为菊科六棱菊属植物六棱菊[Laggera alata（D.Don）Sch.Bip.ex Oliv]的全草。六棱菊样品信息见表1。

表1 广西壮族自治区内10批不同产地的六棱菊样品信息Tab 1Sample information of 10 batches of L.alatafromdifferentareasinGuangxi Zhuang Autonomous Region

2 方法与结果

2.1 六棱菊中咖啡酸提取工艺优化

2.1.1 单因素考察（1）提取方法考察。从六棱菊中提取咖啡酸的方法主要有回流提取法、超声提取法、浸渍法、渗漉法、煎煮法等[14]。以咖啡酸提取时间1 h、料液比1∶40、提取溶剂45%乙醇为提取条件，分别采用回流提取法、超声提取法和溶剂浸渍法提取六棱菊中的咖啡酸。结果，回流提取法对咖啡酸提取率较高，故采用回流提取法。（2）乙醇体积分数考察。固定咖啡酸提取时间为3 h、料液比为1∶40，采用回流提取法，以乙醇体积分数为10%、25%、45%、65%、95%提取六棱菊中咖啡酸并计算得率。结果，25%乙醇回流提取率较高，但与10%乙醇提取效果差别不大。从减少乙醇溶剂方面考虑，选用10%乙醇为提取体积分数。（3）料液比考察。固定咖啡酸提取时间为3 h、乙醇体积分数为10%，采用回流提取法，以料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60提取六棱菊中咖啡酸并计算得率。结果，料液比为1∶40时咖啡酸得率较高，故选用料液比为1∶40。（4）提取时间考察。固定料液比为1∶40、乙醇体积分数为10%，采用回流提取法，以提取时间为1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 h提取六棱菊中咖啡酸并计算得率。结果，提取时间为2.5 h时咖啡酸得率较高，故选用提取时间为2.5 h。

2.1.2 正交试验设计根据文献[15]和参考2015年版《中国药典》（一部），以乙醇体积分数（A，%）、料液比（B，g/mL）、提取时间（C，h）为考察因素，以咖啡酸含量作为评价指标，按3因素3水平选用L9（34）正交表进行试验。各因素水平及试验结果见表2、表3，方差分析结果见表4。

表2 因素与水平Tab 2Factors and levels

表3 正交试验设计与结果Tab 3Orthogonal test design and results

表4 方差分析结果Tab 4Result of variance analysis

由表3可知，各提取因素对六棱菊提取工艺的影响顺序为A＞C＞B，即乙醇体积分数对六棱菊的提取工艺影响最大，其次是提取时间，最后是料液比。由表4可知，乙醇体积分数对六棱菊提取具有显著影响，而料液比和提取时间无显著影响，所以对六棱菊中咖啡酸成分提取效果有显著影响的因素是乙醇体积分数。因此，本试验最理想的提取方案是A1B3C3，即乙醇体积分数为10%、料液比为1∶40、提取时间为3 h时，提取效果最佳。

2.1.3 工艺验证试验以优选出的咖啡酸提取条件进行六棱菊中咖啡酸提取的验证试验。分别称取3份六棱菊药材粉末，分别为0.500 6、0.500 1，0.500 9 g，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，平行进行3次测定。计算六棱菊中咖啡酸含量分别为0.521 4、0.514 8、0.527 1 mg/g，平均含量为0.521 1 mg/g，RSD＝1.18%（n＝3）。验证试验表明，优化后的咖啡酸提取条件较好，工艺可行。

2.2 高效液相色谱法测定六棱菊中咖啡酸的含量

按文献[15-16]和参考2015年版《中国药典》（四部）方法测定含量。2.2.1色谱条件色谱柱为Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸（22∶78，V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为320 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。按照上述条件测定，各组分分离度良好，见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1HPLC chromatograms

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品16.2 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得咖啡酸对照品贮备液，质量浓度为0.81 mg/mL。精密量取上述咖啡酸对照品贮备液2 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，即得咖啡酸对照品溶液，质量浓度为64.8 μg/mL。精密量取上述对照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，即得咖啡酸对照品溶液，质量浓度为12.96 μg/mL，此咖啡酸浓度用于做线性方程。

2.2.3 供试品溶液的制备精密称取六棱菊药材粉末0.5 g，使用10%乙醇提取，回流，以离心半径0.65 cm、13 000 r/min离心10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 方法学考察按相关方法进行检测。结果显示，所用色谱条件分离效果良好，提取溶剂对咖啡酸测定无干扰，咖啡酸出峰时间为6.8 min。以咖啡酸进样量为横坐标（x）、峰面积为横坐标（y）进行线性回归，得回归方程为y＝4×106x－22 912（r＝0.999 1），检测限为10.60μg/mL，咖啡酸进样量的线性范围为0.025 92～0.259 2μg；精密度试验中，RSD＝2.25%（n＝6）；稳定性试验中，样品溶液室温放置24 h的峰面积RSD＝1.77%（n＝6）；重复性试验中，六棱菊中咖啡酸平均含量为0.455 2mg/g，RSD＝2.86%（n＝6）；加样回收试验中，低、中、高加样量（0.182 1、0.227 6、0.273 1 mg）的六棱菊中咖啡酸的平均回收率分别为98.33%、97.18%、100.07%，RSD分别为1.85%、2.07%、1.31%（n＝3），均符合相关要求。2.2.5样品含量测定分别称取10批不同产地的六棱菊药材粉末（过2号筛）0.5 g，精密称定，按“2.2.3”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.2.1”项下条件测定，采用外标一点法计算咖啡酸的含量，结果见表5。

表5 广西壮族自治区内10批不同产地的六棱菊样品中咖啡酸含量测定结果Tab 5Content determination results of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas in Guangxi Zhuang Autonomous Region

由表5可知，广西壮族自治区内10批不同产地的六棱菊药材中均含有咖啡酸，且咖啡酸含量差异较大，其含量范围为0.375 2～0.776 6 mg/g；其中百色市靖西县的六棱菊药材所含咖啡酸含量最高，明显高于其他产地样品，其次是百色市田阳县、桂林市荔浦县样品，而桂林市平乐县样品咖啡酸含量最低。六棱菊中的咖啡酸含量差异较大，可能是受六棱菊植物生长期与生长环境的共同作用，影响其生长和咖啡酸成分的积累。若仅以咖啡酸成分作为六棱菊药材质量评价的依据，六棱菊的最佳产地是百色市靖西县。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验过程中考察了甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%甲酸、甲醇-水、乙腈-水等系统对样品成分分离效果的影响，结果，乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时，分离度较好，故流动相最终确定为乙腈-0.1%磷酸溶液。

3.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm波长下对供试品和对照品溶液进行全波长扫描，结果咖啡酸在291、320 nm波长下有最大吸收。考虑到291 nm作为检测波长时，溶剂峰大，基线漂移；而用320 nm时，溶剂峰小，基线平稳，咖啡酸响应值较大。故最终采用320 nm作为本试验的检测波长。

3.3 提取方法的选择

本试验过程中还考察了提取溶剂（甲醇、乙醇）、不同体积分数的乙醇（10%、45%、95%）、提取方法（超声和加热回流）和提取时间（1、2、3 h）对样品提取结果的影响。结果，10%乙醇溶液加热回流3 h提取效果好。

综上，本试验优选工艺提取咖啡酸含量重复性较好；建立的咖啡酸含量测定方法稳定、可行。

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Technology Optimization and Content Determination of Caffeic Acid in 10 Batches of Laggera alata from Different Areas

WEI Jiangcun1，CHEN Yong1，XIE Zhen1，LI Yaohua1，TANG Chunli2，QUE Zuliang1，YU Yanhe1，ZHANG Xin1，PANG Danqing1（1.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530020，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of caffeic acid in Laggera alata，and establish a method for its content determination.METHODS：The caffeic acid in L.alata was extracted by reflux extraction.Using extraction content as investigation index，orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol volume fraction，material-liquid ratio and extraction time on caffeic acid，and the extraction technology conditions were optimized.HPLC was adopted to determine the content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas，using caffeic acid as reference substance，at wavelength of 320 nm.RESULTS：The optimized extraction technology conditions were as follows as ethanol volume fraction of 10%，material-liquid ratio of 1∶40 and extraction time of 3 h.Under the condition，verification test for caffeic acid was carried out，and the average content of caffeic acid in L.alata was 0.521 1 mg/g（RSD＝1.18%，n＝3）.The content of caffeic acid in 10 batches of L.alata from different areas ranged in 0.375 2-0.776 6 mg/g，and the content showed great differences.CONCLUSIONS：The content of caffeic acid in L.alata is related to area and harvest season.The caffeic acid extration by optimized technology shows good reproducibility；and the established method for content determination is stable and feasible.

Laggera alata；Content determination；Caffeic acid；HPLC

R914.1

A

1001-0408（2017）34-4792-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.10

国家自然科学基金资助项目（No.81260673、81360524）；壮瑶药协同创新中心项目（No.桂教科研〔2013〕20号）；广西壮瑶药重点实验室项目（No.桂科基字〔2014〕32号）；广西中医药大学科研创新项目（No.YJS201625）；广西重点学科壮药学项目（No.桂教科研〔2013〕16号）；广西八桂学者中药创新理论与药效研究项目（No.J13162）；广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室项目（No.桂教科研〔2014〕6号）

＊硕士研究生。研究方向：药物质量控制。电话：0771-3137585。E-mail：WJC2553@163.com

#通信作者：教授，硕士生导师。研究方向：中药及其制剂质量分析。电话：0771-3137585。E-mail：cy6381@163.com

2017-01-24

2017-09-29）

（编辑：余庆华）