DEAB促进肝癌细胞凋亡及增强其对ADM敏感性的机制研究

张 俊 薛新波 申 铭 郑建伟 肖朝文

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科，湖北 武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院肝胆胰外科，湖北 武汉 430014)

DEAB促进肝癌细胞凋亡及增强其对ADM敏感性的机制研究

张 俊1，2薛新波1申 铭1郑建伟1肖朝文2

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科，湖北 武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院肝胆胰外科，湖北 武汉 430014)

目的 探讨ALDH抑制剂DEAB致肝癌细胞凋亡及增强其对ADM化疗敏感性的具体机制。方法 通过DEAB干预肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02以及与经ADM处理的HepG2和L02细胞。通过流式细胞仪检测各组细胞中活性氧(ROS)的表达变化及Annexin-V和PI双染后细胞凋亡量的变化。通过Realtime PCR及western blot方法检测各组细胞中Bcl-2、Bax、ALDH1以及MDR1基因和蛋白的变化。结果 DEAB干预HepG2细胞后，致使其ROS表达增强、凋亡量增加，ALDH1基因和蛋白表达无明显变化，Bcl-2、MDR1基因和蛋白表达下调，Bax基因和蛋白表达上调。正常肝细胞系L02无以上变化。结论 抑制ALDH可致肝癌细胞系HepG2凋亡，并增强其对ADM的化疗敏感性。而对正常肝细胞系L02无此作用。

DEAB；ROS；线粒体凋亡；肝癌；化疗；ALDH

原发性肝癌治疗效果不理想,其容易发生化疗耐药、复发和转移，为临床诊治造成许多困难。本课题组围绕肝癌的基因治疗已经进行了许多研究。ALDH是线粒体中调节氧化应激的关键酶，可以有效清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)及其副产物，抑制氧化应激所致的细胞凋亡。并且能惰性化化疗药物，使得肿瘤细胞对于其耐药。因此，将ALDH作为治疗靶点，有希望诱导肝癌细胞凋亡，逆转化疗耐药，提高患者生存率。

本研究通过ALDH特异性抑制剂DEAB转染肝癌细胞后，研究其致肝癌细胞凋亡和增强肝癌细胞对ADM的敏感性的机制，以及ALDH作为治疗靶点在其中的作用，为肝癌的基因治疗提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞 肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02由本课题组保存。

1.1.2主要试剂 OS检测试剂盒，Annexin-V和PI凋亡检测试剂盒， Realtime PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)，β-actin、Bcl-2、Bax、ALDH1、 MDR1一抗(美国santa cruz公司)，ECL试剂盒。

1.2方法

通过ROS检测确定DEAB浓度：将DEAB分别按10-6mol/l ，5×10-6mol/l，10-5mol/l，5×10-5mol/l，10-4mol/l五个浓度加入培养的HepG2细胞中，检测其ROS的产量，挑选最合适的浓度。

将肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02分别分为四组：对照组，DEAB组，ADM组，DEAB+ADM组。各组药物和病毒用量如下：对照组加入PBS，ADM组和DEAB+ADM组中阿霉素浓度为1.5 mg/L，DEAB组和DEAB+ADM组中DEAB浓度为5×10-6mol/l，处理时间为48 h。进行ROS检测、凋亡检测、realtime PCR检测、Western blot 实验。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1五组不同浓度的DEAB作用于HepG2细胞，流式检测其ROS产量，三次重复，5×10-6mol/l处为活性氧产量拐点，因此是最适的浓度。

各组细胞ROS检测表明：ADM，DEAB，以及联用ADM+DEAB均能刺激细胞内ROS产量增加，给予细胞线粒体凋亡途径的启动刺激，其中联用ADM+DEAB组效果最明显，各组结果的差异具有统计学意义，见表 1。

2.2各组的凋亡检测结果表明ADM，DEAB，以及联用ADM+DEAB均能诱导肝癌细胞凋亡，细胞凋亡量依次增加，ADM+DEAB组效果最明显，见表2。

表1 各组细胞ROS检测

表2 各组的凋亡检测结果

Realtime PCR检测结果显示，DEAB对ALDH1基因表达无明显影响，作用于肝癌细胞后，使得Bcl-2和MDR1基因表达下调，Bax基因表达上调。而联合用药组效果最明显。L02组则无此效果。

Western blot 结果表明：DEAB对ALDH1蛋白表达无明显影响，抑制ALDH功能后，使得Bcl-2和MDR1蛋白表达下调，Bax表达上调。而联合用药组效果最明显。

图1 Western blot 结果

3 讨 论

乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)是细胞内一种重要的抗氧化酶，作用主要是将乙醇代谢途径中产生的乙醛氧化成乙酸，最后分解为二氧化碳和水。近年来研究发现ALDH活性与肿瘤有关，如在肝癌及其他许多人类肿瘤的致瘤过程中，ALDH活性被有所改变[1]。ALDH作为线粒体中调节氧化应激的关键酶，可以有效清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)及其副产物，抑制氧化应激所致的细胞凋亡，其抑制凋亡作用与Bcl-2蛋白家族的表达密切相关。而本研究结果显示，采用DEAB抑制ALDH的作用后，肝癌细胞内ROS产量增加，ALDH不能起到有效的清除作用，从而启动了肝癌细胞的凋亡，导致肝癌细胞凋亡增加，而在正常肝细胞中效果不明显。

在本研究中，我们还发现抑制ALDH后，Bcl-2表达下调，Bax表达上调。这表明作为线粒体凋亡途径中的关键因子，Bcl-2和Bax的表达与活性氧的氧化应激密切相关。各种促凋亡信号引起细胞内源性或外源性活性氧升高产生氧化应激而启动凋亡。多项研究表明在肿瘤细胞中的活性氧基础水平高于正常细胞[2]，因而肿瘤细胞中活性氧诱导剂更容易打破氧化还原的平衡而产生氧化应激。

蛋白组研究发现肺癌细胞对阿霉素(adriamycin，ADM)的耐药性与ALDH表达水平正相关[3]。阿霉素(ADM)是肝癌治疗中常用的一种化疗药物，肝癌细胞对化疗药物的的耐受性是化疗效果不理想的主要原因。细胞中MDR-1基因的表达，可使细胞膜上的P-糖蛋白(P-gP)过度表达，通过其药物泵的作用将药物排出细胞外，使得胞内的药物浓度下降，是导致MDR的主要原因之一[4]。所以降低P-gP的表达水平，可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究的结果运用DEAB显示抑制ALDH的功能可以显著抑制MDR1基因的及其蛋白表达，而联合应用DEAB和ADM其效果显著提高。

综上所述，ALDH通过抗ROS的氧化应激而抑制肝癌干细胞凋亡及导致其化疗耐药。ALDH是肝癌的理想的治疗靶点，可以诱导肝癌干细胞凋亡，逆转化疗耐药，从而获得更好的疗效。

[1] Magni M,Shammah S,Schiro R,et al. Induction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde-dehydrogenase gene transfer[J]. Blood, 1996.87:1097-1103.

[2] Morebj S, Schweder M, Suresh A, et al. Overexpression of the human aldehyde dehydrogenase class I results in increased resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide[J]. Cancer Gene Ther, 1996, 3(1): 24-30.

[3] Keenan J, Murphy L, Henry M, et al. Proteomic analysis of multidrug-resistance mechanisms in adriamycin-resistant variants of DLKP, a squamous lung cancer cell line[J]. Proteomics, 2009, 9(6): 1556-1566.

[4] Perugorria MJ，Castillo J，Latasa MU，et al．Wilms'tumor 1 gene expression in hepatocellular carcinoma promotes cell dedifferentiation and resistance to chemotherapy[J]．Cancer Res，2009，69：1358-1367．

Research on the Mechanisms of the DEAB induced Apoptosis and chemotherapy sensitivity enhancement of ADM in hepatoma carcinoma cells

ZHANGJun1,2XUEXin-bo1SHENMing1ZhengJianwei1YuYuan3XIAOChao-wen2

(1.Dept.ofPancreaticSurgery,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030China;2.Dept.ofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,WuhanCentralHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China)

Objective: To investigate the mechanisms of the DEAB (ALDH inhibitor) induced apoptosis and chemotherapy sensitivity enhancement of ADM in hepatoma carcinoma cells. Methods: We interposed the HepG2 cells、normal liver cell line L02 and HepG2、L02 cells were treated by ADM with DEAB. Changes of expression of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were detected by flow cytometry in the each group. Changes in gene and protein level of ALDH1, Bcl-2 and of Bax and MDR1 were detected by Realtime PCR and western blot. Results: The function of ALDH were inhibited in HepG2 cells, resulting in increased expression of ROS and apoptosis; expression of Bcl-2 and MDR-1 gene and protein were down regulation; expression of Bax gene and protein was up regulation; there were no such changes in the normal liver cell line L02.Conclusion: The apoptosis of HepG2 cells was induced and the ADM sensitivity to chemotherapy was enhanced by the inhibition of ALDH, but there was no effect in the normal liver cell line L02.

DEAB; ROS; mitochondrial apoptosis; liver cancer; chemotherapy; ALDH

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院博士科研基金(YB13B01)；武汉市卫生计生委科研基金(WX14D07)。

张俊(1984—)，男，湖北黄冈人，医师，博士，主要研究方向：肝胆胰肿瘤。

R735.7

A

1004-7115(2017)12-1328-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.003

2017-08-28)